1.2. Взаимосвязь процессов старения и перекисного окисления липидов

1.2.1. Роль ПОЛ в процессах старения, хорошо освещённая в литературе, состоит, прежде всего, в образовании активных метаболических продуктов, которые участвуют в превращении липидов – основного субстрата перекисного окисления. Вследствие преимущественного окисления ненасыщенных жирных кислот в составе липидов с возрастом происходит их замена на насыщенные кислоты, нарушается стабильность мембран продуктами ПОЛ, в избытке образующихся при старении и многих возрастных болезнях, изменяются функциональные свойства встроенных в мембраны ферментов, рецепторов и других белковых компонентов (Bermond, 1991; Holgado et al., 1994).

Данные такого рода получены в экспериментах путём исследования различных органов и тканей животных и человека на возрастное «пероксигеназное» повреждение. К примеру, с увеличением возраста мышей С57В1/6 с 1 до 15-ти мес. содержание малонового диальдегида (MDA) в печени соответственно возрастало, активность же антиоксидантных ферментов – GPX, каталазы, митохондриальной и цитозольной SODs понижалось (Parkhouse et al., 1995). У крыс пожилого возраста наблюдали истощение запасов восстанов-ленного глутатиона (GSH) и увеличение содержания окисленного (GSSG), усиление вызываемой свободными радикалами хемилюминесценции, а также снижение активности глутатионредуктазы и повышение активности глутатионтрансферазы. Наиболее выраженными эти изменения были в печени и мозге (Calabrese et al., 1998). Уровень ПОЛ в почках и печени, оцениваемый по содержанию в них свободных радикалов, увеличивается с возрастом параллельно с падением уровня компонентов антиоксидантной системы. А DL-α-липоевая кислота снижает у старых крыс количество липидных перекисей и повышает антиоксидантный статус (Arivazhagan et al., 2000).

Анализ изолированных почечных клубочков и культивируемых мезанги-альных клеток, взятых у 3- и 18-месячных крыс Fischer 344, показал повышение содержания О , Н₂О₂ и продуктов ПОЛ у 18-месячных животных (Ruiz-Torres et al., 1997). Старение 3-4-месячных крыс, наблюдавшихся в течение длительного времени, сопровождалось снижением в почках клубочковой филь-трации на 60 %, увеличением в 3 раза в их ткани содержания F₂-изопростанов – F₂-простагландиноподобных веществ, образующихся в процессе неферментативного перекисного окисления арахидоновой кислоты. Потребление животными корма с высоким содержанием витамина Е (5000 ед/кг) препятствовало возникновению этих возрастных патологических сдвигов, указывая, что старение почек связано с окислительным стрессом (Reckelhoff et al., 1998). Однако изопростаны F₂ являются не только точными маркёрами этого стресса при старении in vivo (Roberts, Reckelhoff, 2001), но также вызывают и сильнодействующие биологические эффекты. Поэтому изопростаноиды могут быть медиаторами окислительного повреждения in vivo (Imbusch, Mueller, 2000). Любопытно, что, по данным этой же работы, серия аналогов изопростана F₂, называ-емых фитопростанами, образуется и в растениях. Подобно изопростанам у млекопитающих, они могут представлять чувствительную меру окислительного повреждения в растениях при поранении и различных стрессах, которые запус-кают резкое увеличение фитопростанов.

Если изменения, подобные указанным, носят всеобщий характер, то старе-ение животного организма, в том числе человеческого, должно сопровож-даться увеличением чувствительности к окислительному стрессу. Такой факт установлен, в частности, при исследовании окислительного стресса у женщин в возрасте старше 75 лет по результатам анализов продуктов ПОЛ, энзиматичес-ких и неэнзиматических антиоксидантов (Cristol et al., 1997). Об этом свидетельствует показанное с использованием тролокса (тушителя радикалов) снижение у здоровых 100-летних людей общей антиокислительной активности сыворотки крови, обусловленное, как считают (Petruzzi et al., 1997), повышенным образованием свободных радикалов.

На большую чувствительность старых клеток к воздействию прооксидантов косвенно указывает и следующий материал. В культуре гепатоцитов крыс циклоспорин А вызывал дозозависимое увеличение выработки внутриклеточных перекисей, которое у животных 12-месячного возраста было значительно выше, чем у 2-месячных. Рост уровня перекисей приводил к снижению жиз-неспособности гепатоцитов и сопровождался адаптивным повышением активности Mn- и Cu/Zn-SOD и их мРНК (Andres et al., 2000а). Очевидно, циклоспорин А, известный как ингибитор пор во внутренней мембране митохондрий, замедляя скорость потребления ими О₂, повышает внутриклеточное рО₂ и приводит тем самым к развитию избыточного ПОЛ. Поскольку в старых клетках такие условия в какой-то степени были уже созданы ранее, в процессе старения, то указанная выше цитотоксичность циклоспорина А проявляется в них, естественно, легче, быстрее и более заметно, чем в «неподготовленных» к этим изменениям молодых клетках.

Любые внешние воздействия, создающие гипероксию и (или) интенсифицирующие перекисное окисление в клетках и тканях, можно рассматривать как «простаренческие». Известно, например, что при длительной гипероксии или недостатке антиоксиданта -токоферола возникают ярко выраженные изменения в морфологии клеток, особенно неделящихся, аналогичные возрастным изменениям (Donato, 1981). Ингаляция озона вызывает у мышей нарушение баланса про- и антиоксидантных процессов в организме, усиление признаков старения. В частности, происходят ослабление функциональной активности различных систем организма, накопление MDA в сыворотке крови (Wang D. et al., 1998). Свободное железо в форме Fe²⁺ приводит к образованию весьма активного гидроксильного радикала, который, реагируя с липидом LH, вызы-вает цепной разветвлённый процесс окисления с участием L , LО , LО и гидроперекисей LООH (подробнее об этом см. п.2.1.7 в главе 2).

Избыток Fe²⁺ в течение длительного времени может привести к устойчивой интенсификации ПОЛ мембран клетки. При неферментативном ПОЛ, индуцированном Fe²⁺, CCl₄ или аскорбатом, в печени старых крыс накапливаются продукты ПОЛ вследствие повышенного образования и замедленного их разрушения. Действительно, в гепатоцитах старых крыс образовывалось в 3 раза больше MDA, а скорость элиминации токсичного продукта ПОЛ альдегид-4-гидроксиноненаля была достоверно ниже, чем в гепатоцитах молодых крыс (Chiarpotto et al., 1994). Известно также, что при хронической пищевой нагрузке железом увеличивается скорость ПОЛ митохондрий и микросом печени крыс. В этом плане неудивительно, что избыток железа в пище повышает скорость старения живых организмов, а средняя продолжительность их жизни уменьшается (Soha l et al., 1985).

Различные типы стареющих клеток отличаются пониженной пролифера-цией и изменённой морфологией, которые могут быть связаны с повышенной величиной отношения активностей Cu,Zn-SOD/GPX и образованием более высокого уровня Н₂O₂. Такой дефект присущ, в частности, фибробластам лиц с синдромом Дауна, проявляющим, в отличие от фибробластов здоровых людей, признаки раннего старения (De Haan et al., 1996). Негативные пероксигеназные процессы в стареющих клетках нарушают, естественно, функцию построенных из них органов и структурных их компонентов. Кроме упомянутых выше печени и почек, «пероксигеназному» старению подвергаются и все другие органы. Большая информация накоплена, например, по функциональным нарушениям глаза в связи с высокой чувствительностью всех его структур к действию свободных радикалов. Особое внимание уделено роли последних в процессах перерождения и старения стекловидного тела глаза, которые значительно ускоряются у диабетиков, приводя к стойкому изменению состава и структуры этого тела, вплоть до отслоения сетчатки (Deguine et al., 1997).

В другой работе (Beatty et al., 2000) обобщены данные об участии окисли-тельного стресса в патогенезе возрастной дегенерации жёлтого тела сетчатки глаза. Последняя подвержена повреждающему действию биохимических про-цессов с интенсивным поглощением О₂, чему способствуют относительно высо-кое содержание в сетчатке полиеновых жирных кислот и действие на неё видимого света. Представлены факты причастности указанных окислительных процессов к генерации АФК, которые негативно действуют на липиды, белки и нуклеиновые кислоты клеток сетчатки. Особую роль в окислительном повреждении тканей глаза играет Н₂О₂, образование которого в известной мере связывается с метаболическими превращениями аскорбиновой кислоты. Введение Н₂О₂ в переднюю камеру глаза молодого кролика вызывало в тканях изменения, сходные с имеющими место у взрослых животных (Green, 2001).

Тепловое воздействие и особенно радиация являются непосредственны-ми интенсификаторами свободнорадикальных процессов ПОЛ, причём для ионизирующего излучения характерна гиперпродукция свободных радикалов О₂ внутри и вне клетки. В этой связи понятно, почему радиационное старение в значительной мере адекватно отражает процесс физиологического старения, подчиняясь тем же основным закономерностям, но отличаясь большей скоро-стью (Обухова и др., 1998). Солнечное ультрафиолетовое (УФ) излучение при длительном воздействии на открытые участки кожи вызывает окислительный стресс и преждевременное их старение, а нередко – развитие рака кожи и меланомы (O^'Connor, O^'Brien, 1994; Dore et al., 1997). Под влиянием этого излучения достоверно подавляются компоненты антиоксидантной системы (GPX, SOD, GSH, липорастворимые антиоксиданты) и интенсифицируются процессы ПОЛ в различных тканях животных и человека. Наиболее чувствительным к таким изменениям оказался уровень GSH в коже. Кроме того, большинство из указанных сдвигов обнаруживается также в крови УФ-облучённых людей (Платонов, Кудряшов, 1997).

Тепло и радиация индуцируют повреждения в ДНК, сходные с накапливающимися с возрастом (Виленчик, 1989). С течением времени в живых организмах значительно изменяется структура как отдельных молекул, так и сконструированных из них надмолекулярных образований, в частности фибрилл. Так, в процессе развития и роста организма в коллагене естественным образом увеличивается число внутри- и межмолекулярных поперечных ковалентных связей (сшивок). Сходные перестройки в коллагене происходят и под влиянием вредных для организма внешних ускоряющих старение факторов, прежде всего ионизирующего излучения (Белопольская и др., 1994). А недавно в опытах in vivo показано, что УФ-облучение индуцирует появление фактора транскрипции АР-1 с последующей экспрессией регулируемых им металлопротеиназ. Последние могут разрушать фибриллярный коллаген кожи и эластичные волокна. Предобработка ретиноидами, в частности третиноидом, снижала эти УФ-индуцированные эффекты и, очевидно, способна предотвращать развитие фотостарения (Kang, 1998).

Подробный анализ данных по лучевому старению, старению в присутствии повышенных концентраций О₂ и при обогащении рациона ненасыщенными легко окисляемыми липидами был приведён ещё в известных обзорах Обуховой и Эмануэля (1983, 1984). Действенность этих экзогенных факторов по мере старения клеток должна возрастать ввиду постулируемой в них относительной гипероксии (сравнительно с уровнем рО₂ в клетках молодого организма). Эта гипероксия, возникающая по-видимому, и при хроническом ситуационном стрессе, определяет повышенные радиочувствительность старых организмов (Топольникова, 1999), чувствительность их к цитотоксическому действию О₂ (De Clercq et al., 1988) и особенно АФК (Gracy et al., 1999).

Обсуждаемым материалам и кислородно-перекисной концепции старения вообще противоречат, естественно, представления о ведущей роли гипоксии в старении (Коркушко, Иванов, 1980), но эта точка зрения не подтверждается и рядом других исследователей. Например, Мартин и соавторы (Martin et al., 1984) так и отмечают: «не подтверждается предположение, что недостаток О₂ может быть первичной причиной старческих изменений в органах и тканях». Такие изменения, по их мнению, есть результат накопления аномальных продуктов метаболизма O₂ в виде свободных радикалов, приводящих к характерным для старения сдвигам на биохимическом и клеточном уровнях.

1.2.2. Одним из наиболее очевидных и заметных изменений клеток при старении живых организмов является накопление в их цитоплазме флуоресцентных пигментов старения (FAPs), в том числе липофусцина. Измерение уровня их аккумуляции в постмитотических клетках считают основой определения биологического (физиологического) возраста индивидуального организма (Strauss, 1999). В обширной литературе по старению о фактах образования липофусцина – этого сложного соединения, имеющего сопряжённые связи и поперечные сшивки, сложилось единодушное мнение. Основную роль в генезе липофусцина играют процессы ПОЛ с последующей (или одновременной) полимеризацией низкомолекулярных альдегидов с первичными аминогруп-пами белков. В результате образуются соединения типа шиффовых оснований (см. рис.1), благодаря присутствию которых липофусцин обладает свойством автофлуоресценции. Измерение флуоресценции шиффовых оснований в области 420 - 470 нм является известным методом изучения ПОЛ вообще, поскольку позволяет обнаруживать очень небольшие количества продуктов ПОЛ в таких образцах, как митохондрии и микросомы (см. Осипов и др., 1990).

Накопление возрастного пигмента в постмитотических клетках рассматривается, как одно из доказательств свободнорадикальной теории повреждения клеток при старении и может служить показателем хронологического возраста, надёжным маркёром старения клеток, в частности нейронов (Nandy et al., 1988; Sharma, Singh, 1994). В этой связи интересны следующие закономерности, установленные, в основном, в 80-х годах. Накано и соавт. (Nakano et al., 1989), исследуя липофусцин в клетках миокарда 50-дневных – 19-летних японских макаков, обнаружили, что гранулы его начинают появляться с 1.5 – 2-летнего возраста, в дальнейшем их количество линейно увеличивается с возрастом. Сравнение же с данными по другим видам животных выявило: возраст, при котором наблюдается появление гранул липофусцина, коррелирует с максимальной продолжительностью жизни животных; скорость накопления этих гранул более высока у животных с небольшой продолжительностью жизни, чем у долгоживущих; скорость накопления липофусцина связана с возрастом наступления половой зрелости животных обратной зависимостью.

В других работах (см., например, Matsugo et al., 2000) установлено, что у мышей линии SAMP1, характеризующихся ускоренными темпами старения и значительно меньшей продолжительностью жизни (по сравнению с таковой у контрольных мышей линии SAMR1), в тканях накапливаются продукты свободнорадикального окисления липидов, в том числе липидные гидроперекиси. Ускоренное старение мышей SAMP1 связывают с падением эффективности систем утилизации АФК в их тканях. Действительно, в мозге этих животных существенно снижена активность Cu,Zn-SOD, активность же мембраносвязан-ной Mn-SOD вообще оказалась очень низкой (Болдырев и др., 2001).

Прекрасную возможность для подтверждения роли свободнорадикальной пероксидации в образовании липофусцина клетки дают исследования по влиянию железа на этот процесс. В одной из таких работ миоциты сердца крысы культивировали в среде с добавлением железа либо его хелатора десферриоксамина при содержании О₂ в воздухе 20 или 40 %. Контролем служили те же куль-туры клеток в среде без добавок. Содержание липофусцина определялось на 6-й и 12-й дни роста клеток без пересева. Как и ожидалось, количество его было больше в культурах, растущих в среде с добавлением железа, причём железо и О₂ оказывали кумулятивное действие на накопление липопигмента. Десферриоксамин оказывал противоположное действие. Все эффекты были более выражены при большей концентрации О₂ (Marzabadi et al., 1988). Авторы заключили, что окислительный стресс вызывает накопление липофусцина и что с помощью микроспектрофлуориметрического определения его можно оценивать интенсивность окислительных процессов в клетке.

Ускоренному отложению липофусцина в клетках различных тканей способствует также отсутствие в рационе питания антиоксидантов, например вита-мина Е. У животных, получавших пищу без -токоферола, липофусцин накапливается в различных органах 1.5 – 6 раз быстрее (Donato, 1981; Goyal, 1982). В частности, диета с недостатком витамина Е вызывает более быстрый рост количества гранул липопигмента в цитоплазме нейронов мышей. Одновременно у них снижается способность к обучению и ухудшается память. Напротив, пища с избытком витамина Е тормозит накопление липофусцина в мозге мышей и улучшает память по сравнению с контролем (Nandy et al., 1988).

Весьма интересны данные о том, что в липофусциновых гранулах присутствуют каротиноиды и что часть таких гранул представляет собой функционально активные каротиноксисомы. Последние по Карнаухову (1988) являются внутриклеточными образованиями, участвующими в «энергообеспечении молекулярных механизмов клеток животных в условиях, когда митохондрии не могут функционировать ввиду их повреждения или из-за недостатка О₂».По существу, каротиноксисомы представляют систему внутриклеточного депонирования О₂ за счёт обратимой оксигенации – деоксигенации каротиноидов с использованием их сопряжённых двойных связей. Такая система обеспечивает «подпитку» клеток кислородом во время периодически наступающей метаболической их активности, связанной с резким возрастанием в этот период энергетических потребностей.

Таким образом, Карнаухов рассматривает накопление в клетках животных и человека липофусциновых гранул – каротиноксисом как процесс адаптации тканей стареющих организмов к прогрессирующей с возрастом внутритканевой гипоксии. Накопление каротиноксисом происходит и в тканях молодых животных, помещённых в атмосферу с низким рО₂ (Sulkin, Srivanija, 1960), а также в клетках искусственно ишемизированных частей органов молодых животных (Татарюнас и др, 1980), что связывается авторами только с адаптацией к гипоксии. По указанным фактам и в развитие идеи адаптации можно представить следующий ход событий. При старении организма поступление О₂ в клетки лимитируется нарушениями в сосудистой системе и внешнем дыхании. К состоянию гипоксии клетки адаптируются сокращением своей митохондриальной базы (подробнее об этом см. в п.1.3.1 и 1.6.1). В результате потребление ими О₂ уменьшается, а внутриклеточное рО₂ возрастает и в зависимости от степени сокращения «лишних» митохондрий может даже превысить обычные в норме низкие значения.

В связи с указанным отметим, что накопление липофусциновых гранул – каротиноксисом происходит именно на фоне деградации митохондрий. Отсюда следуют два важных, на наш взгляд, и логичных вывода: возникающая внутриклеточная гипероксия, способствует протеканию процессов ПОЛ, продукты которых необходимы для образования липофусцина; часть из накапливающихся гранул липопигмента включает в себя молекулы каротиноидов, обладающие акцепторно-донорными свойствами, что позволяет им выполнять регуляторную функцию наподобие рессивера или сглаживающего устройства: аккумулировать в себе избыточный кислород, снижая его цитотоксическое действие, и высвобождать О₂ при гипоксии в клетке. По-видимому, именно такой функцией каротиноидов, и не обязательно в составе липофусцина, можно объяснить прямую корреляцию между их содержанием в сыворотке крови и тканях мозга приматов и максимальной продолжительностью жизни последних.

Каротиноиды способствуют не только долгожительству, но и обеспечивают защиту организма от развития злокачественных опухолей и сердечно-сосудис-тых болезней (Rao, Agarwal, 2000). Низкое же их содержание в организме коррелирует с малигнизацией различных тканей (Steinel, Baker, 1990). Более того, антиоксидантные и иммуностимулирующие свойства каротиноидов, способно-сть их регулировать коммуникацию клеток (т. н. gap-junction) важны не только для понимания противоопухолевого эффекта каротиноидов, но и для регуля-ции пролиферации и дифференцировки клеток в течение эмбриогенеза (Surai, Sparus, 2000).

Перечень работ по FAPs и, в частности, по липофусцину продолжает пополняться новыми и в последние годы. Так, исследование экстрактов ткани надпочечника крыс различного возраста методом флуоресценции показало, что интенсивность флуоресценции повышается по мере старения крыс. Например, у животных возраста 2 и 24 мес. она составляет соответственно 16.39 10³ и 34 10³ усл. ед. Параллельно происходит увеличение образования перекисей липидов – уровень их возрастал с 172.97 до 640.83 нмоль MDA/г ткани. Продукты ПОЛ, предположительно, накапливаются в липофусциновых гранулах ткани надпочечника (Almeida et al., 1998).

Об отложении с возрастом липофусциновых гранул в коре надпочечников человека и грызунов сообщили также другие исследователи (Cheng B. et al., 1999), которые, правда, связали этот негативный сдвиг с недостаточностью функции адренокортикотропного гормона. Обработка в течение 6 недель молодых или старых фибробластов лёгочной ткани человека выделенным из конских бобов растворимым белком, «сборщиком» свободных радикалов, ограничивала накопление липофусцина в клетках, но и здесь этот процесс как-то увязывается с влиянием гормонов, в данном случае гидрокортизона (Okada, Okada, 2001). Любопытны также материалы об аккумуляции FAPs в тканях головного мозга 4-х видов Poecilidae – семейства рыб из отряда карпозубообразных. У всех этих видов была установлена статистически значимая положительная корреляция между уровнем флуоресценции, хронологическим возрастом и общей величиной тела (Strauss, 1999).

Наконец, тот факт, что липофусцин образуется не только в постмитотических клетках, но и в делящихся, например, в клетках печени, коры надпочечников, семенников (см. Канунго, 1982), на ранних этапах развития насекомых, в тканях личинок и куколок (Обухова, 1986), подтверждает ещё один важный момент: уровень ПОЛ при митогенезе в принципе достаточен для формирования липофусциновых гранул, а термин «окислительный митогенез» вполне оправдан.

Судя по серьёзным публикациям последних лет, интерес к проблеме «ПОЛ и старение» не спадает, выявляются новые продукты, эффекты и связи, имеющие отношение к «пероксигеназному» механизму старения. Так, повсеместно распространённым продуктом ПОЛ, загрязняющим среду и образующимся в различных биологических системах, считают акролеин (СН₂-СН-СНО). Связанный с белками, акролеин воспринимается как маркёр окислительного стресса и стабильных окислительных модификаций белков при старении (Uchida et al., 1998). Постепенно круг сторонников тесной взаимосвязи процессов ста-рения и ПОЛ среди исследователей расширяется, а уровень аргументации и информативности работ возрастает. Об этом свидетельствуют и материалы, изложенные в последующих параграфах данной главы.