3.4. Некоторые вопросы преобразований и реализации пролиферативного сигнала

Рассмотрим теперь некоторые возможные механизмы формирования груп-пы родственных по Васильеву (1986) реакций клетки на активацию рецепторов и их модификацию в норме и при опухолевой трансформации. При этом учтём, что при стимуляции деления нормальных клеток происходит преходящее сни-жение степени межклеточных контактов, а для опухолевых клеток ослабление межклеточного сцепления является характерной их особенностью. Временное изменение контактных свойств клеток в сторону их подавления рассматри-вается как одно из необходимых условий для возможности реализации нормального окислительного митогенеза.

3.4.1. События, происходящие на разных стадиях формирования и передачи митогенного сигнала, достоверно ешё не выяснены. Некоторые из них могут заключаться в следующем. Лигандо-рецепторные комплексы, выполнившие свою сигнал-индуцирующую функцию, подвергаются эндоцитозу. Их продви-жение во внутрь клетки осуществляется, вероятно, не без участия натягива-ющих усилий при сокращении актиновых пучков, прикреплённых к внутренней поверхности плазматической мембраны и заякоривающих, в частности, моле-кулы фокальных контактов, рецепторы. В какой-то момент срабатывает меха-низм подавления актомиозиновой сократимости и высвобождения указанных интернализованных комплексов. Определённую роль здесь может играть PKC, фосфорилируя цитоскелетные белки (например, миозин) и локализованный у концевых участков микрофиламентов винкулин.

Такой же акт разрыва связи с мембраной и цитоскелетом производится по отношению к рецепторам и поверхностным структурам, контактирующим с соседними клетками или с лигандами на субстрате. Это служит, по-видимому, одной из немаловажных причин исчезновения или снижения степени соответ-ственно межклеточных контактов и распластывания. Определённый вклад в такую перестройку вносят также дефицит ATP и cAMP, активация матричных металлопротеаз и протеаз других классов в стимулированных клетках (см. п. 2.4). В норме после деления в дочерних клетках восстанавливаются все необходимые структуры для воспроизведения в очередном цикле рецепции, межклеточных связей, распластывания, эндоцитоза – всей этой группы родст-венных реакций (Васильев, 1986).

Если агрегация рецепторов – необходимое условие для проявления биоло-гического действия комплекса лиганд - рецептор, то и послеледующая интерна-лизация рецепторов не менее необходима для реализации в цитоплазме и ядре сигнальных функций продуктов распада рецепторов. При этом «функция собст-венно лиганда сводится к тому, чтобы обеспечить конформационные изменения в молекуле рецептора и избирательный эндоцитоз рецепторов данной специ-фичности» (Кульберг, 1987). Применительно к рецепторам факторов роста внутриклеточный протеолиз должен приводить к высвобождению их цитоплаз-матического домена со свойствами тирозинкиназы. К этому событию может быть причастна и активация в плазматической мембране стимулированных клеток ферментативных пероксигеназных реакций, в ходе которых генери-руются АФК (например, ОН˙ в реакциях, катализируемых LOXs и COXs). Свободные радикалы кислорода в норме участвуют в металлокатализируемом окислении различных белков, в том числе, по-видимому, рецепторного белка. Окислительная же модификация белков повышает их чувствительность к эндо-генному протеолизу (Дубинина, Шугалей, 1993).

Предполагается, что после внутриклеточного расщепления интернализо-ванного рецептора его цитоплазматический домен сохраняет каталитические свойства и способен функционировать самостоятельно, не обладая лишь воз-можностью связывать лиганд. Какие-то свои первоначальные функции интерна-лизованные рецепторы всё же теряют. Например, имеются данные, что после интернализации рецепторы EGF становятся дефектными в отношении стиму-ляции PLC-γ1 (Haugh et al., 1999). Конкретные функции высвобождённого домена с тирозинкиназной активностью точно не выяснены, но определённые соображения здесь со ссылкой на литературные сведения всё же высказыва-ются. Так, выявленная связь EGF с активацией ДНК-топоизомеразы II обус-ловлена, вероятно, транслокацией в ядро цитоплазматического домена рецеп-тора данного фактора и воздействием его на топоизомеразу, которая ковалентно связана с 5′-концом растущей нити ДНК посредством фосфотирозиновых связей (см. Кульберг, 1987).

По другим данным, активность ДНК-топоизомеразы II, связанной с ДНК и ядерным матриксом, резко возрастает при пролиферации клеток в результате фосфорилирования PKC, содержание которой в этот период значительно повышается (Heck et al., 1988). По всей видимости, в данной акции участвует другая, модифицированная PKC, транслоцированная в ядро из плазматической мембраны. Возможное образование такой PKC рассмотрели Кухарь с соавт. (1991) и некоторые другие исследователи. По их представлениям, повышение концентрации Са²⁺ в цитоплазме при активации PPI-системы приводит к связы-ванию с мембранами кальпаинов – Са²⁺-зависимых протеаз. Последние могут гидролизовать мембранную PKC с образованием фрагментов, обладающих про-теинкиназной активностью, но уже не чувствительных к фосфолипидам, Са²⁺ и DAG. Переходя в цитоплазму и даже в ядро, такие активированные каталити-ческие субъединицы PKC фосфорилируют различные внутриклеточные белки и обусловливают соответствующие «плановые» эффекты. Таким образом, при стимуляции сигнальной PPI-системы последовательно реализуются Са²⁺-, PS-, DAG-зависимый путь активации PKC в клеточной мембране и кальпаин-зави-симый – в цитоплазме и, по-видимому, в ядре. В этой связи любопытно, что в структуре PKC имеются участки, сходные по своей аминокислотной после-довательности с ДНК-связывающими доменами некоторых металлопротеидов и других ДНК-связывающих белков, которые участвуют в регуляции транс-крипции (Nishizuka, 1988).

По всей вероятности, транслокация различных ферментов, в частности рецепторных, из цитоплазмы в ядро – процесс неслучайный, а по необходи-мости закреплённый в ходе биологической эволюции. Фактический материал в поддержку этого положения постепенно накапливается. Например, интернали-зованный рецептор EGF обнаружен в ассоциации с транскрипционным фак-тором STAT1, который связывается также с кориоферинами α – факторами, опосредующими ядерный транспорт макромолекул. Оба комплекса показывают сходную динамику при стимуляции клеток ростовым фактором (Василенко и др., 2001). О ядерной локализации некоторых рецепторных тирозинкиназ сооб-щают, помимо упомянутых выше, и другие публикации. Так, в клетках NIH 3T3, трансформированных протоонкогеном neu крысы, его продукт p185^neu (принадлежит к семейству рецепторов EGF и представляет собой тирозинки-назу) присутствует как в неядерной фракции, так и в небольшом количестве в ядре. Последнее подтверждено иммунофлуоресцентным методом, причём ядер-ный белок p185^neu имеет более высокий уровень фосфорилирования тирозина, чем неядерный. Биологический смысл транслокации рецепторных тирозинкиназ в ядро видят в том, что с их участием реализуется трансактивация транс-крипции (Xie, Hung, 1994).

С учётом ранее рассмотренных представлений ответные гипотезируемые реакции клетки на активацию рецепторов приведены на рис. 18. Там же отра-жено известное положение о том, что в норме сдвиг цитоплазматического рН в щелочную сторону является ранним и необходимым проявлением действия различных митогенов (Schwartz et al., 1989), снижает концентрацию ATP в клетке (Пархоменко и др., 1989), активирует синтез ДНК и пролиферацию. Дан-ный вопрос важен ещё и для понимания взаимосвязи между изменением рН в цитоплазме и отмеченным в п. 3.1.3 нарушением адгезивных и межклеточных взаимодействий при активации пролиферации, особенно в плане того, чтó из них первично и чтó вторично или же они происходят независимо друг от друга. Бесспорными здесь считаются пока два момента: 1) в качестве одного из важных звеньев в активации клеточной пролиферации митогенами участвует Na⁺/H⁺-антипортер, ведущий к защелачиванию цитоплазмы; 2) для пролифе-рации большинства нормальных клеток необходима предварительная адгезия их к твёрдому субстрату, который формально может рассматриваться как рос-товой фактор. В связи со сказанным исследователей интересовало, как изме-

Взаимодействие факторов роста и других митогенов с соответствующими рецепторами

Включение неизвестного пока механизма устранения сфингомие-линового или ганглиозидного заслона между рецепторами ПМ

Объединение разрозненных «заякоренных» рецепторов в кластеры, образование митогенных генераторов кластерного типа

Активация ГЦ и повышение концентрации сGМP

Активация тирозиновой ПК как цитоплазматического домена рецепторов или сопряженной с ними PLC

Стимуляция PPJ-системы (образование DAG, активация PКС, PLА₂, липо-и циклооксигеназных сигнальных путей)

Белки

c-src

c-ros

Ингибирование АЦ, снижение уровней сАМР и сАМР-стимули-руемого дыхания, повышение уровней ПОЛ и АФК

Активация Na⁺/H⁺-антипортера

Разборка мембран ЭР, увеличение числа свободных рибосом и синтеза белков для внутри-клеточных нужд

Повышение рН в цито-плазме

Разъякоривание и избирательный эндо-цитоз лигандореце-пторных комплексов определенной специфичности

Высвобождение цитоплазматического домена рецепторов, PКС и других ферментов, транслокация их в ядро

Снижение cАМP-зависимого синтеза «адгезивных» молекул, ослабление контактных структур и межклеточного сцепления

П Р О Л И Ф Е Р А Ц И Я К Л Е Т К И

Рис.18. К механизму формирования группы «митогенных» реакций клетки на активацию рецепторов

ПМ-плазматическая мембрана; ПК-протеинкиназа; АЦ-аденилатциклаза; ГЦ-гуанилатциклаза; ЭР-эндоплазматический ретикулум. Остальные обозначения даны в тексте.

Дефицит АТP

Интерна-лизация рецепторных комплексов

Дестабилизация микрофила-ментов

няются адгезионные и пролиферативные процессы при различных способах закисления цитоплазмы.

Стандартным приёмом снижения рН в клетках является угнетение Na⁺/H⁺-обмена ингибитором Na⁺/H⁺-антипортера амилоридом. Последний, как отме-чают Марголис и Розовская (1988), закислял цитоплазму прикреплённых и суспендированных клеток на 0.3 ± 0.04 единицы, что коррелировало со значи-тельным падением способности клеток к адгезии. Так, число прикрепившихся к субстрату клеток под действием амилорида уменьшалось в ~50 раз по сравне-нию с контролем. Сходный эффект имел место при снижении рН внутри клеток до 6.6 в результате закисления наружной среды до 6.5. Ресуспендирование же клеток в среде с рН 7.6 вновь вызывало защелачивание цитоплазмы и восста-новление способности клеток к адгезии. Подобные в принципе данные полу-чены и в других работах (Schwartz et al., 1989; Ruch et al., 1990).

Таким образом, адгезия клеток зависит от внутриклеточного рН и, следова-тельно, от работы Na⁺/H⁺-антипортера, активируемого PKC (Скулачев, 1989) – «пролиферативным» для большинства типов клеток ферментом. В свою оче-редь, та же адгезия клеток к твёрдому субстрату (подложке) или митогенные факторы, не связанные с субстратом, необходимы для активации PKC опосре-дованно через «включение» соответствующих рецепторных тирозинкиназ, сиг-нальной PPI-системы, одной из изоформ PLC и образование DAG (см. п. 3.1.2). Выходит, в действительности функциональные связи в триаде «защелачива-ние – адгезия (контакт с подложкой) – пролиферация» не являются простыми, в них имеется ещё ряд неясных моментов, а в некоторых публикациях по дан-ному вопросу встречаются противоречивые выводы. Для правильного понима-ния существа и «логики» указанных связей следует, на наш взгляд, исходить из того факта, что PKC не только активирует Na⁺/H⁺-антипортер, но и оказывает негативное воздействие на межклеточные и, вероятно, фокальные контакты (см. п. 2.4.1 и 3.1.3). Можно предполагать также, что антиконтактный, антиадгези-онный эффект PKC разнесён во времени с другими её эффектами и проявля-ется лишь в связи с интернализацией лиганд-рецепторных комплексов и других поверхностных структур, на этапе «очистки» поверхности клеток.

Во избежание дальнейшего усложнения схемы на рис. 18 не показаны не-которые известные и важные промежуточные стадии. Это касается прежде всего ряда последствий, вызываемых дефицитом ATP. Не отражены, в част-ности, эффекты, связанные со снижением активности Ca²⁺-ATPазы, увеличе-нием в клетке концентрации Ca²⁺ и тем самым способствующие окисли-тельному митогенезу.

3.4.2. Опираясь на изложенные соображения, попытаемся представить ме-ханизм нарушения упомянутых выше процессов при опухолевой трансфор-мации и разобраться в парадоксальной, как считают, ситуации: нормальная клетка может размножаться только после распластывания, которое после трансформации ухудшается, но на размножении не отражается; более того, трансформированная клетка может размножаться даже без распластывания (Васильев, 1986).

Прежде всего, при опухолевой трансформации дискретная PPI-система регуляции с PS-зависимой PKC оказывается в условиях избыточного ПОЛ в значительной степени парализованной. Однако теперь начинает действовать на постоянной основе другой сигнальный путь, в котором роль главного управ-ляющего звена выполняет, по всей видимости, продукт протоонкогена c-src – нерецепторная тирозинкиназа pp60^c-src. При этом однозначного мнения о меха-низме реализации ею такой функции пока нет. Не вызывает сомнений лишь то, что в различных типах опухолевых клеток киназа c-src обычно сверхэкс-прессирована (Biscardi et al., 1998; Lutz et al., 1998 и др.), и одной из вероятных причин этого являются постулируемый нами кислородно-перекисный стресс в указанных клетках и данные об активации белка c-src некоторыми АФК, нап-ример О и Н₂О₂ (Lee et al., 1996; Griendling et al., 2000).

В клетках, дефицитных по белку c-src, напротив, обнаруживается блокада клеточного цикла. Такой факт установлен, в частности, в линии Т-лимфоцитов, полученной путём подавления в них с помощью антисмысловой РНК экспрес-сии src-киназ, причём клеточный цикл блокировался между фазой G₂ и митозом (Al-Ramadi, 1999). Сниженная экспрессия c-src уменьшает пролиферацию и усиливает дифференцировку остеобластов и образование кости (Marzia et al., 2000). Семейство тирозинкиназ src взаимодействует с внутриклеточными доме-нами некоторых рецепторов, в частности, β₃-адренергического (Cao et al., 2000), с заякоренными через гликозилфосфатидилинозитол белками в плазматической мембране Т-лимфоцитов (Ilangumaran et al., 2000), с как рецепторными, так и нерецепторными тирозинкиназами. Среди последних чаще всего отмечают вхо-дящие в состав рецепторов EGF и PDGF (Parsons, Parsons, 1997). Субстратом для c-src, наряду с рецептором EGF, служат киназа фокального контакта и неко-торые соединения из семейства Rho (Haskell et al., 2001). Исследования меха-низма указанных взаимодействий и их эффектов не привели к достаточной ясности, ввиду противоречивости некоторых полученных фактов. Обращают на себя внимание, в частности, следующие.

Будучи фосфорилированным по тирозину 527 онкобелок c-src теряет свою активность, причем это фосфорилирование обеспечивается не его собственной киназой, а какой-то иной клеточной протеинкиназой (Thomas et al., 1991). Таковой, возможно, является тирозинкиназа рецепторов различных факторов роста и других митогенов. Если это действительно так, то подобная акция ингибирования могла иметь приспособительный характер для того, например, чтобы при нормально действующем канале формирования и передачи митоген-ного сигнала, когда рецепторная тирозинкиназа сама имеет прямой выход на сигнальную PPI-систему и активирует ее (Olson, 1985), отключать временно подменяющий в каких-то случаях фермент pp60^c-src.

С предполагаемым актом негативного воздействия тирозинкиназы рецеп-тора фактора роста на онкобелок c-src, возможно, связан известный феномен ингибирования эпидермальным фактором роста пролиферации опухолевых клеток с аномально высоким содержанием его рецепторов. Данный эффект может быть результатом того, что протеинкиназа многочисленных рецепторов надёжно прерывает действие молекул src-белка, как одних из главных эндоген-ных ферментов, причастных к имитации митогенного сигнала (см. ниже). По этим соображениям при высоком содержании EGF и его рецептора пролифе-рация клеток неоплазмы и должна блокироваться. Интересно, что в специ-альном эксперименте из эпидермоидной карциномы А431 выделены штаммы, обладающие устойчивостью к антипролифератиному эффекту EGF. Получен-ные варианты в течение 50 пассажей сохраняли резистентность к высоким концентрациям фактора роста, не теряя при этом характерных для опухолевых клеток свойств (Гудкова и др., 1988). По-видимому, проведенная в данноё работе селекция привела к тому, что способность тирозинкиназы рецепторов EGF инактивировать фермент c-src оказалась нарушенной.

Вообще же, существует множество взаимодействий, которые различными путями репрессируют каталитическую активность киназы c-src, поддерживая аутоингибированное ее состояние. Благодаря комплексной природе этих взаи-модействий, нарушение любого из них может сдвигать равновесие от ингиби-рованного состояния к активному (Hubbard, 1999). А в определенных пато-логических ситуациях из-за таких нарушений функционирование клеточного src-белка может оказаться неконтролируемым. Здесь уместно также указать на данные о том, что Sam68 – мультимерный РНК-связывающий белок с мол. м. 68 кД, взаимодействующий с онкобелком src во время митоза, вовлечен в слу-чае его недостаточности в пролиферацию и неопластическую трансформацию фибробластов мыши NIH 3T3. Уменьшение содержания белка Sam68 на ~25 % от уровня дикого типа ведет к формированию колоний в 0,5 % агаре, наруше-нию контактного торможения роста и способствует образованию метастати-ческих опухолей у безволосых мышей. Эти результаты соответствуют тому, что у вступающих в митоз клеток уровень белка Sam68 значительно снижается (Liu K. et al., 2000). По-видимому, при дефиците Sam68 его «репрессорные» функ-ции в отношении src устраняются или ослабляются, и теперь данный онкобелок относительно свободен в действиях, связанных с вовлечением его в проли-ферацию и онкогенез.

С изложенными выше представлениями не согласуются данные, по кото-рым в клетках NIH 3T3 и PC12 с усиленной эндогенной экспрессией рецептора EGF этот фактор, напротив, активирует тирозиновые протеинкиназы семей-ства src, с чем связывается возможная роль src-киназ в туморогенезе (Osherov, Levitski, 1994). Механизм этой прямо противоположной акции пока неизвестен. Не исключено, однако, что непосредственное отношение к ней имеет другой любопытный феномен: в клетках карциномы A431 src-белок обнаруживается исключительно в мембранной фракции клеток, где он находится в комплексе с рецепторами EGF; прединкубация клеток A431 с этим ростовым фактором увеличивает содержание белка c-src в комплексе и стимулирует аутофосфори-лирование src-белка в этих комплексах. Показано также, что в связывании с рецепторами EGF участвует последовательность белка c-src между аминокис-лотными остатками 413 и 431 (Sato et al., 1995). Указанное аутофосфорили-рование присоединившейся «чужой» тирозинкиназы напоминает стимулиро-ванное фактором роста аутофосфорилирование рецептора его «собственной» тирозинкиназой.

На существование механизма активации фермента c-src, подобного рассма-триваемому, похоже, указывают данные Велброка и соавт. (Wellbrock et al., 1995), изучавших возможную роль тирозинкиназ семейства src в развитии меланомы у рыб Xiphophorus. Эти рыбы характеризуются сверхэкспрессией и высокой активностью рецепторной тирозинкиназы, которая ответственна за образование наследственной меланомы, но механизм передачи сигнала неиз-вестен. В эксперименте in vitro было показано, что эти ферменты образуют между собой стабильные комплексы, причём после стимуляции рецепторной тирозинкиназы активность киназ семейства src повышается, т. е. последние, считают авторы работы, могут играть важную роль в развитии меланомы.

Сходная в принципе информация получена при изучении эффекта сверхэкс-прессии рецептора EGF и продукта протоонкогена c-src (Maa M.-Ch. et al., 1995). При такой «двойной» сверхэкспрессии src-белок потенцирует синтез ДНК, способность к пролиферации в полужидком агаре и к образованию клет-ками опухолей у голых мышей. Существенно, что указанное потенцирование сочетается с образованием гетерокомплекса c-src с активированным рецептором EGF, фосфорилированием по тирозину рецептора и субстратов рецепторной киназы. По этим фактам сделан вывод: ассоциированная с мембраной цитоплаз-матическая тирозинкиназа c-src потенцирует опосредуемый рецептором тумо-рогенез; синергизм c-src и рецептора EGF может привести к возникновению более агрессивного фенотипа при множественных опухолях у человека. О молекулярном механизме синергизма c-src и рецептора EGF как субстрата для c-src речь идёт и в другой работе (Haskell et al., 2001).

Как уже отмечалось, белок онкогена c-src фосфорилирует по тирозину вин-кулин, ассоциированный с концевыми участками микрофиламентов, и талин, локализованный в фокальных контактах, причём фосфорилирование винкулина предшествует дестабилизации цитоскелета в процессе трансформации (Strube et al., 1985). На примере фибробластов СЗН10 Т1/2 установлен также важный факт: участие фермента c-src в одновременной реорганизации актинового цитоскелета, белков р190 и р120 как предпочтительных его субстратов. Пока-зана необходимость c-src для митогенного эффекта EGF, который индуцирует быструю временную конденсацию указанных белков в цитоплазматические дугообразные структуры. Образование последних коррелирует с активностью c-src, а разборка и повторная сборка актиновых фибрилл происходит соответ-ственно реорганизации р190 и р120 (Chang J.-H. et al., 1995). С дестабилизацией цитоскелета при усиленной экспрессии c-src естественно связать факт принятия клетками NIH 3T3 сферической формы, правда, без утраты ими потребности в подложке для пролиферации (Kato, Maeda, 1997). По-видимому, это какой-то промежуточный вариант состояния между необходимыми для пролиферации нормальной и трансформированной (или опухолевой) клеток.

Не менее существенной является способность продукта протоонкогена c-src в качестве фосфатидилинозиткиназы увеличивать концентрации PIP, PIP₂, DAG, IP₃ и активировать пролиферацию клеток (Фаворова, 1986; Ивашкин и др., 1987). Важно и то, что фосфорилирование указанных выше субстратов осуществляется теперь в отличие от PKC непрерывно действующим онкобел-ком-ферментом, т. е. не подвергающимся дестабилизации в пероксигеназных условиях опухолевой клетки.

Нерецепторная src-тирозинкиназа может участвовать в онкогенезе, влияя также на внутриядерные процессы и, в частности, активируя белки семейства STAT – латентные факторы транскрипции, которые определяют транскрипцию, индуцируемую цитокинами и факторами роста. После фосфорилирования тиро-зина они транслоцируются из цитоплазмы в ядро и активируемые некоторыми АФК (Simon et al., 1998) связываются с адресными сайтами промоторов. Пока-зано, например, что экстракт ядер клеток NIH 3T3 или BALB/c 3T3, трансфор-мированных онкобелком v-src, активирует белок STAT3 и/или STAT-родствен-ные белки, повышая их ДНК-связывающую способность. Подобный, но более слабый, эффект оказывает и онкобелок c-src. Предположительно, белки семей-ства STAT участвуют в регуляции генов, ассоциированных с онкогенезом (Yu Ch.-L. et al., 1995; Татосян, Мизенина, 2000). В клетках NIH 3T3, избыточно экспрессирующих c-src при воздействии ростовых факторов, имеет место пози-тивная регуляция фосфорилирования и ДНК-связывающей способности белков STAT1 и STAT3, причём, по данным иммунопреципитации, c-src непосредст-венно образует комплекс с STAT1 (Cirri et al., 1997). Участие киназы c-src в активации STAT1, вызванной EGF, подтверждено путём использования фарма-кологического ингибитора src-киназ и клеток, нокаутированных по гену c-src (Василенко и др., 2001а). Подобно v-src, c-src способен стимулировать ДНК-связывающую активность молекул STAT3 на модели F9 клеток тератокар-циномы, фосфорилируя эти молекулы по тирозину (Schaefer et al., 1999).

Наряду с src-белком, определённые негативные последствия оставляет и вмешательство онкобелков ros, mil и ras в функционирование PPI-системы (Фаворова, 1986; Ивашкин и др., 1987). Вместе они ответственны за образова-ние достаточного количества ненуклеотидных вторичных мессенджеров и мета-болитов фосфоинозитидов, необходимых для реализации последующих этапов пролиферативного процесса (см. п. 3.2). Митогенные сигналы возникают теперь непрерывно с участием «собственных» внутренних стимуляторов. Они, с одной стороны, противодействуют формированию полноценных цитоскелетных и контактных структур, а с другой, активируют образование соединений, кото-рые участвуют в преобразовании, передаче и реализации пролиферативного сигнала или создают необходимые условия для этих этапов. Поэтому характер-ные для нормальной клетки реакции на внешний стимул в виде эндоцитоза лиганд-рецепторных комплексов или распластывания при трансформации про-являются слабо или вовсе отсутствуют: они теперь полноценно не осущест-вимы и не обязательны для размножения, поскольку взамен подключены другие постоянно действующие эндогенные стимуляторы, обеспечивающие в усло-виях пероксигенации относительную автономность опухолевой клетке.

В рассмотренных моделях опухолевой трансформации остаётся неясным механизм изменения экспрессии клеточных онкогенов (протоонкогенов). По-видимому, наряду с перестройкой генетического аппарата в форме транслока-ции подвижных его элементов и амплификации клеточных генов, в том числе протоонкогенов, к экспрессии последних ведут и эпигенетические механизмы. Некоторые из них были уже рассмотрены в главах 1 и 2 – это модификация ядерных белков, прежде всего негистоновых, путём их фосфорилирования, ADP-рибозилирования, взаимодействия с АФК и продуктами ПОЛ и др. Ещё один возможный механизм активации протоонкогенов – гипометилирование ДНК, которое обычно способствует транскрипции части генома. Как известно, для различных типов опухолевых клеток характерны общее снижение уровня метилирования ДНК и связанная с ним нестабильность генома (Kanai et al., 1999; Vilain et al., 1999).

Причины деметилирования генома и конкретные механизмы, обусловли-вающие его канцерогенный эффект, остаются невыясненными (Лихтенштейн, Киселева, 2001). Известна, правда, следующая точка зрения. Активация cAMP-зависимых ДНК-метилаз повышает уровень метилирования ДНК (протоонко-генов), что приводит к выключению этих протоонкогенов. При дефиците же cAMP общий уровень метилирования ДНК будет снижаться, затрагивая и протоонкогены, а это может вызвать их включение (Ходосова, 1988). Кстати, возрастное гипометилирование ДНК, способствуя экспрессии некоторых про-тоонкогенов, должно быть причастным к увеличению частоты опухолей при старении (Анисимов, 1988). При опухолевой трансформации наряду с экс-прессией протоонкогенов происходит обратное в отношении антионкогенов, экспрессия которых или активность их продуктов (р53, pRb) подавляются.

Что касается предполагаемого участия ферментативной составляющей ре-цептора в процессах биосинтеза и репликации ДНК, а также в транскрипции, то такая возможность сохраняется и даже, по-видимому, возрастает в условиях опухолевой клетки, поскольку усиление окислительной модификации белков повышает их чувствительность к эндогенному протеолизу. Может быть, опре-делённый процент рецепторов расщепляется уже до встраивания в плазмати-ческую мембрану, а сборка ещё какого-то количества рецепторов вообще не происходит при окислительной модификации отдельных их доменов. В ука-занных случаях сигнальные функции рецепторных ферментов в цитоплазме и ядре могут в принципе реализовываться вне связи с интернализацией и после-дующим эндоцитозом соответствующих рецепторов.

Таким образом, развитие процесса пролиферации оказывается, по крайней мере, в вышеуказанной части, неконтролируемым, не зависящим от факторов роста и других стимуляторов пролиферации. Подключение тирозинкиназных онкобелков к активному функционированию PPI-системы и фосфорилированию ими целого ряда внутриклеточных мишеней фактически означает, что трансформированная клетка перешла на автономный режим, в котором дейст-вия указанных эндогенных онкобелков внутри клетки имитируют нормальную реакцию локализованных в плазматической мембране структур на экзогенные ростстимулирующие факторы. В реализации последующих этапов многосту-пенчатого процесса пролиферации участвуют и некоторые другие онкобелки (см. Збарский, 1988; Эренпрейс, 1988; Лю, Шайхутдинов, 1991 и др.).

3.4.3. Обратим теперь внимание на следующие «разумные» с точки зрения управления эффекты, связанные с функционированием PKC, PPI- и других систем сигнализации. Речь идёт о разнонаправленной реакции клеток на один и тот же агонист и обеспечении непротиворечивой регуляции.

Как известно, показатели пролиферации и дифференцировки на всех ста-диях созревания клетки обычно находятся в обратной зависимости и могут даже носить взаимоисключающий характер. По этой логике, стимуляция с помощью TPA пролиферации клеток должна тормозить их дифференцировку, но имеющиеся на этот счёт данные противоречивы. Форболовые эфиры спосо-бны как ингибировать дифференцировку определённых типов клеток, так и сти-мулировать дифференцировку других. Если для большинства типов нормаль-ных негемопоэтических клеток они являются опухолевыми промоторами, мито-генами, то гемопоэтические и, частности, лейкозные клетки HL-60, K562, U937 и другие отвечают на их воздействие не иначе, как остановкой клеточного цикла и дифференцировкой (см Garsia-Bermejo et al., 1997; Kwon et al., 2000; Абелев, 2001 и цитируемую ими литературу.). В таком же направлении реаги-руют клетки промиелоцитарного лейкоза человека NB4, резко усиливая адге-зию на клеточные стромы костного мозга (Lanotte et al., 1992).

Указанные соединения, предположительно, активируют различные кле-точные биохимические механизмы, но включение их может быть следствием активации одного клеточного феремента – РКС, которая, как уже отмечалось, представляет собой целое семейство белков, экспрессирующихся тканеспе-цифично (Nishizuka, 1988; Clemens et al., 1992). В частности, антипролифе-ративное действие эфиров форбола на лейкозные клетки связывают с экспрес-сией ими изофермента РКС-β (Macfariane, Manzel, 1994), некоторые субтипы которого имеют ядерную локализацию. Так, в ядрах эритролейкозных клеток Френд содержится субтип РКС-βI, обладающий ДНК-связывающей активно-стью (Mallia et al., 1996). Если подобный принцип задействован природой и для некоторых регуляторных белков, зависимых, например, от вторичных мессен-джеров, то в этой ситуации принципиально реализуемы структурно-функцио-нальные решения, приспособленные для смены знака эффекта на обратный. Эти соображения призваны объяснить разную реакцию клеток различных тканей (стимуляция синтеза, секреции, деления, дифференцировки и т. п. или, нап-ротив, их ингибирование) на один и тот же промотор, фактор роста или вторичный мессенджер (Романчиков, 1991).

В отношении фосфолипидо- и Са²⁺-зависимой РКС возможен и совершенно иной способ изменения знака ответной реакции, связанный с заменой PS в микроокружении этого фермента на другое соединение. Например, фосфатид-ная кислота в присутствии Са²⁺ и диолеина оказывает, в отличие от PS, ингиби-рующее действие на РКС, выделенной из мозга крыс (Epand, Stafford, 1990). Не исключено, что в каких-то типах клеток подобной заменой в процессе эволю-ции отобран способ изменения знака ответа РКС на обратный, т. е. вместо известной связки «активация РКС – стимуляция пролиферации» при воздейст-вии, в частности, опухолевых промоторов индуцируется дифференцировка.

Вообще же, наиболее очевидный способ разнонаправленного управления процессами реализуется по схеме, когда одни и те же эндогенные сигнальные молекулы могут связываться с рецепторами разных типов, изначально «настро-енных» на генерацию сигналов противоположного действия. Хорошо известно, например, что катехоламины, связываясь с β-адренорецептором, активируют аденилатциклазу и синтез сАМР, взаимодействие же их с α₂-адренорецептором приводит к обратному эффекту. При этом противоречивые ситуации (состо-яния) в клетке не возникают, поскольку «на поверхности клеток определённого типа рецепторы эндогенных биостимуляторов представлены преимущественно каким-либо одним подтипом» (Кухарь и др., 1991). Этими же авторами приведён подробный перечень биорегуляторов и их рецепторов с указанным характером взаимодействия с клеточными сигнальными системами.

Целенаправленная и эффективная регуляция клеточных процессов объясня-ется и рядом других оригинальных решений природы. Одним из них предста-вляется способность TPA и DAG подавлять связывание эпидермального и других факторов роста соответствующими рецепторами. Такая трансдукция рецепторов осуществляется, как известно, ферментом РКС путём фосфори-лирования их по остаткам серина и треонина, что, в свою очередь, подавляет стимулируемое фактором роста аутофосфорилирование рецептора тирозинки-назой, входящей в состав рецепторного комплекса. Эти факты отражают, по-ви-димому, необходимый здесь логически понятный принцип: обеспечение един-ственности и непротиворечивости воздействия на клетку разных стимули-рующих факторов в конкретный момент времени путём снижения сродства к соответствующим рецепторам гетерологичными лигандами. Подобный запрет при воздействии труднометаболизируемого TPA должен быть продолжитель-ным, по существу необратимым и потому эффективным.

В литературе приводится множество данных о неспецифической опосредо-ванной РКС десенсибилизации опухолевыми промоторами (форболовыми эфи-рами) рецепторов различных факторов роста, гормонов и других агонистов. В частности, кроме рецепторов факторов роста, блокированными оказываются рецепторы инсулина, трансферрина, ангиотензина, α₁-, α₂- и β-адренорецеп-торы и др. Так, активация РКС в мышиных фибробластах приводила к ослаблению стимулирующего действия α_1В-адренорецепторов на концентрацию внутриклеточного Са²⁺ и продукцию инозитфосфата. Эти десенсибилизируемые РКС рецепторы подвергались фосфорилированию в базальном состоянии и в присутствии форболового эфира или норадреналина (Gagcia-Siinz et al., 1999). В α_2А-адренергическом рецепторе Ser 232 служит чувствительным к РКС пере-ключателем сопряжения рецептора с эффектором. Вследствие РКС-зависимого фосфорилирования Ser 232 этот рецептор оказывается относительно десентизи-рованным к сигнализации (Liang et al., 2001). В отношении же рецепторов TNF было показано, что активация РКС в клетках различных линий форболовыми эфирами во всех случаях снижает их концентрацию на клеточной поверхности (Holtmann et al., 1990).

Ингибирующее действие короткоживущего DAG на рецепторные системы происходит, по-видимому, в ином, прерывистом режиме при очередной замене отработавших его молекул новыми. Поэтому суммарный митогенный сигнал, возбуждаемый не TPA, а другими стимулирующими агентами с подключением канала обратной связи «DAG – PKC», может не достигать в среднем порогового значения и, следовательно, быть пригодным для реализации. Противодействие блокированного по указанному каналу преодолевается лишь приоритетным адаптированным к конкретному типу клеток ростовым фактором или гормоном за счёт, вероятно, количественного превосходства их рецепторов, гарантирую-щего в этом случае достаточный в среднем уровень интегрального митогенного сигнала. Последующие события при действии таких агонистов – фосфорили-рование и распад инозитлипидов, раздвоение сигнального пути с образованием DAG и IP₃ и ряд других процессов в плазматической мембране – сходны с наблюдаемыми при действии TPA.

В целом создаётся впечатление, что принцип «субординации» и логически непротиворечивой регуляции с помощью РКС, аденилатциклазной и PPI-сис-тем, а также других механизмов являются универсальными. Взаимодействие различных сигнальных систем между собой должно исключать одновременное и/или противоречивое их функционирование. Очевидно, без подобной «логики» во взаимоотношениях различных рецепторных комплексов и сигнальных сис-тем избирательное и целенаправленное управление процессами в клетке в норме невозможно. Проведя в этом направлении систематизацию известных фактов, Кухарь и соавт. (1991) пришли к выводу о реципроктном взаимо-действии аденилатциклазной и PPI-систем сигнализации: активация первой из них (+I) приводит к угнетению второй (–II), а действие типа –I эквивалентно действию +II. Четыре типа реакций этих сигнальных систем (+I, –I, +II и –II) обеспечивают регуляцию самых разнообразных физиологических и биохими-ческих процессов в клетке. Это позволило выделить всего 2 стереотипа дейс-твия физиологически активных веществ: +I/–II и –I/+II.

В общем случае единством, универсальностью и в норме непротиворечи-востью действий характеризуются, очевидно, практически все системы регуля-ции, на любом уровне их организации. Считают, например, что известные вторичные посредники (cAMP, cGMP, IP₃, DAG, комплекс Са²⁺-кальмодулин, 2′,5′-олигоаденилат и др.) функционально связаны между собой и являются компонентами одной из таких внутриклеточных регуляторных систем, контро-лирующей самые различные процессы (Северин и др., 1998). В свою очередь, отдельные подсистемы и целые системы за счёт многочисленных внутри- и межсистемных обратных связей образуют, вероятно, несколько или даже одну сложнейшую глобальную регуляторную систему, способную поддерживать различные показатели (параметры) в клетке в необходимых для конкретного её состояния (этапа развития) пределах.

Рассмотренные выше принципы и схемы регуляции на уровне клетки со временем будут, естественно, дополняться и совершенствоваться. Развитие по-лучит и биокибернетика в целом как наука об управлении в живом. Но сегодня механизмы регуляции многих принципиально важных процессов остаются не-выясненными. К числу последних относятся и вопросы формирования в норме разных клеточных ответов на один и тот же внешний сигнал в случаях, свя-занных с трансмодуляцией рецепторов. Этот феномен может быть составной частью фундаментальной системы регуляции клеточной пролиферации и диф-ференцировки, о чем свидетельствует, на наш взгляд, и поведение трансформи-рующего фактора роста β (TGF-β). Последний опосредует широкий круг био-логических явлений, включая деление клеток, дифференцировку, подвижность, адгезию и их гибель воспаление, защиту организма, восстановление тканей и онкогенез (Wahl, 1994; Weller et al., 2001).

TGF-β, в частности, действует как стимулятор клеточного деления фибро-бластов, но как ингибитор митоза эпителиальных клеток и особенно как силь-ный ингибитор гемопоэза. А в биологии рака функция TGF-β в какой-то сте-пени комплексная: на ранних стадиях образования опухолей TGF-β действует как ингибитор их роста, на поздних же стадиях может стимулировать рост неоплазм (Weller et al., 2001). Объяснение этих во многом ещё неясных эф-фектов TGF-β следует отчасти искать в изменении аффинитета рецепторов к различным факторам роста (см. Киселев и др., 1990), а также в вышеизло-женных соображениях о возможности изменения знака эффекта на обратный уже на начальных стадиях активации сигнальных систем.