2.3. Канцерогенная направленность и следствия глобальной пероксигенации в клетке

Как следует из предшествующего изложения, недостаточность дыхания и возникающая в ответ устойчивая внутриклеточная гипероксия ответственны за повышенную глобальную в масштабе клетки пероксигенацию. Это состояние, с нашей точки зрения, является про- и преопухолегенезным, т.е. в определённом проценте случаев неминуемо приводит к малигнизации клеток и обра-зованию неоплазм. В данном подразделе рассмотрены связанные с указанным состоянием различные структурно-функциональные нарушения, которые определяют качественно и количественно многие характерные для опухолевых клеток признаки и свойства.

2.3.1. С гипероксией и пероксигенацией в клетках активно растущих участков неоплазмы естественно связать более низкие (по сравнению с гомо-логичными нормальными клетками) степень ненасыщенности и содержание мембранных фосфолипидов. При «сжигании» последних, очевидно, «выгора-ют» преимущественно легко окисляемые их фракции – фосфатидилсерин, фосфатидилэтаноламин, фосфатидилинозит, кардиолипин. Наиболее существенным это различие должно быть для митохондриальных фосфолипидов, характеризующихся особенно большой в норме степенью ненасыщенности: на каждый атом фосфолипидного фосфата приходится 3,2 двойных связи жирной кислоты (Козлов и др., 1972). В ходе окислительного процесса они в первую очередь и «расходуются», резко снижая степень ненасыщенности фосфолипидов митохондрий. Наглядные факты по обсуждаемому явлению представлены во многих работах, проводившихся в основном в 80-х годах. Остановимся лишь на некоторых из них.

В процессе диметилнитрозаминового канцерогенеза в печени крыс состав жирных кислот фосфолипидов существенно изменялся. Конкретно индекс нена-сыщенности фосфатидилсерина, фосфатидилинозитола, фосфатидилхолина и кардиолипина снижался в митохондриях и микросомах узелков и гепатом на 30-90 % по сравнению с интактной печенью (Canuto et al., 1986). Эти же авто-ры позднее установили: в липидах из митохондрий и микросом первичных гепатом, индуцированных диэтилнитрозамином, отношения мононенасыщенные/полиненасыщенные жирные кислоты, холестерин/фосфолипиды значительно выше, чем в нормальной печени. Кроме того, найдено, что в гепатоме содержание линолевой кислоты в митохондриальном кардиолипине резко снижается, хотя в нормальной печени оно обычно высокое. Модификация в составе жирных кислот наблюдается уже в гиперпластических узелках (Canuto et al., 1989). В фосфатидилэтаноламине и фосфатидилхолине из клеточных органелл гепатомы содержалось меньше длинноцепочечных полиненасыщенных жирных кислот (PUFAs), чем в таких же фосфолипидах печени (Wood et al., 1986).

В слизистой желудка крыс с развивающейся карциномой уменьшалось со-держание прежде всего фосфатидилэтаноламина, фосфатидилхолина и в меньшей степени – количества фосфатидилинозита, фосфатидилсерина и кардио-липина (Dittrich et al., 1985).А недавно Хышиктуев с соавт. (2000) показали снижение содержания PUFAs (в основном за счёт дефицита линолевой и α-ли-ноленовой кислот) в лёгочной ткани больных раком лёгкого, причём суммарно уменьшалось содержание кислот как серии ω-6, так и серии ω-3. Эти данные получены путём изучения спектра жирных кислот в образцах лёгочной ткани в зависимости от наличия злокачественных клеток, расположенных на разном удалении от очага поражения.

Интересное исследование провели также Лансон с соавт.(Lanson et al., 1990), выявив на примере рака молочной железы человека взаимосвязь жирнокислотного состава мембранных липидов с вероятностью возникновения метастазов. Образцы опухолей брали от больных раком 1-й стадии, не имевших отдалённые метастазы на момент начала наблюдения. Анализы показали, что суммарное содержание арахидоновой и линоленовой кислот, обозначенных в работе как PUFAs n=6 (PUFAs-6), в разных образцах варьирует и составляет 11,6 ÷ 58,4 % от общего содержания жирных кислот, причём уровень PUFAs-6 был ниже у больных, у которых в последующем развились метастазы. Этот факт использован авторами цитируемой работы для прогноза появления метастазов по уровню PUFAs-6. По их статистически достовернвм данным, содержание PUFAs-6 менее 28 % от общего содержания жирных кислот в липидах мембран опухолевых клеток указывает на риск появления метастазов рака молочной железы в лимфатические узлы. Обнаруженная зависимость, с нашей точки зрения, вполне закономерна и отражает степень интенсивности ПОЛ в клетках неоплазмы. Низкий уровень PUFAs-6 свидетельствует о более интен-сивном вовлечении их в пероксигеназные процессы, которые, следовательно, активнее дестабилизируют плазматическую мембрану, прямо или косвенно усиливают нарушение внеклеточного матрикса и межклеточных контактов. Эти деструктивные действия, очевидно, необходимы для инвазии и метастазиро-вания опухолевых опухолевых клеток (см. п. 2.4).

По указанной выше причине для большинства неопластических тканей должно быть характерным относительно высокое содержание более устойчивых к окислению фракций фосфолипидов. Наиболее известны такие данные в отношении сфингомиелина. Например, повышенное количество его выявлено во всех субклеточных фракциях крысиной гепатомы (Wood et al., 1986). В слизистой желудка крыс с аденокарциномой отношение сфингомиелин/фосфати-дилхолин и активность PLA₂ были увеличены в 2-3 раза (Dittrich et al., 1985). Приведённые факты соответствуют тому, что в клеточных мембранах опухоли содержится бóльшее количество насыщенных жирных кислот, чем ненасыщенных (Haeffner et al., 1988).

Степень ненасыщенности и содержание фосфолипидов в плазме крови свя-заны, несомненно, с уровнем таковых в клетках тканей организма. Поэтому присутствие в нём активно растущей неоплазмы, где указанные показатели существенно отличаются от нормальных, должно приводить к их сдвигу в соответствующем направлении и в крови. Этот очевидный, с нашей точки зрения, эффект представлен как изобретение (Машевский и др., 1996). Сущность его состоит в том, что из пробы крови пациента экстрагируют липидную фракцию плазмы, в которой определяют количество двойных связей и при снижении этого показателя относительно нормы диагностируют онкозаболевание.

Для поддержания канцерогенной пероксидативной ситуации клетки неоплазмы нуждаются в источнике ненасыщенных жирных кислот, недостаток которых, к тому же, может быть связан с повреждением в опухолевой клетке мембран микросом (см. ниже), где, как известно, происходит синтез фосфолипидов. Одним из таких источников является усиленный односторонний транспорт липидов в растущую опухоль из других органов «хозяина» (Ланкин, 1971). В этом аспекте весьма интересны данные, полученные в опытах на мышах AKR с трансплантацией им жировой ткани (Kitada et al., 1980). У неголодающих мышей с лимфомами жир мобилизуется быстро, выявляясь в основном в опухолях, у неголодающих же мышей без аномалий мобилизация жира происходит медленно и бóльшая часть его метаболизируется до СО₂, выделяемого при дыхании; сыворотка мышей с опухолями вызывает у нормальных мышей интенсивную мобилизацию жира, не связанную с питанием, а сыворотка нормальных мышей таким свойством не обладает. Поэтому был сделан вывод: сыворотка мышей AKR с опухолями содержит какой-то мобилизующий липиды фактор, секретируемый опухолевыми клетками и обнаруживаемый также в среде культивирования клеток лимфомы мышей AKR и в сыворотке больных с запущенным раком желудка и матки. Фактор этот – термостабильный белок с молекулярной массой 5 кД.

Тем не менее, высокие потребности неоплазмы в ненасыщенных жирных кислотах не удовлетворяются организмом в достаточной мере, и это обстоятельство существенно лимитирует скорость их роста. Но в том случае, когда в организм поступает такой субстрат, он используется для опухолевого роста весьма эффективно, так как существует прямая связь между потреблением легко окисляемых жирных кислот и образованием радикалов О₂ (Забежинский, Анисимов, 1998). Поэтому неудивительно, что повышенное потребление животными пищевых жиров (растительных и животных) приводит к ускорению роста уже образовавшихся опухолей, например, молочной железы. Особенно сильным стимулирующим действие на указанные опухоли, как утверждают авторы обзора (Lee, Lin, 2000), обладает ω-6 PUFA.

Полезная информация на этот счёт получалась и ранее при изучении влияния на рост опухолей животных содержания жиров в диете. Так, масса развившихся после трансплантации аденокарцином молочной железы у мышей C3H и BALB/c и крыс Fischer была различной в зависимости от того, получали ли они только основной рацион (без жиров) или в дополнение к нему принимали 15 % кукурузного масла, содержащего PUFAs. В первом случае масса опухолей животных составляла лишь 47-60 % от таковой во втором случае (Hillyard, Abraham, 1979). В другом эксперименте крысы Sprague-Dawley, получавшие сначала синтетический рацион с высоким содержанием жира (20 % кукурузного масла), были затем переведены на маложировой рацион (0,5 % того же масла) в различные сроки после внутрижелудочного введения им диметилбензантра-цена. Такой перевод задерживал возникновение и развитие опухолей молочной железы у взрослых животных, у молодых же крыс при переводе их на маложировой рацион через 6 нед. после введения канцерогена опухоли развились лишь у 34,8 % животных, в контроле – у 62,5 % (Ip, Ip, 1980). Большая концентрация жиров в корме животных усиливает опухолегенез в толстой кишке, коже, молочной и поджелудочной железах. В случае опухолей толстой кишки показано, что продукты окисления PUFAs и желчные кислоты являются промоторами кишечного канцерогенеза. Митогенность окисленных PUFAs подтверждает роль пищевых жиров в усилении опухолегенеза. Авторы данного исследования (Bull et al., 1989) полагают, что кроме ферментативного пути метаболизма PUFAs возможны и неферментативные реакции их со значительными биологическими последствиями.

Факты, подобные указанным выше, сообщались неоднократно и в последующие годы. Показано, например, что арахидоновая кислота стимулирует рост раковых клеток простаты, причём решающую роль здесь играет 5-LOX. Это вытекало из того, что специфические её ингибиторы полностью подавляли данное действие арахидоновой кислоты, в то время как ингибиторы циклоокси-, эпокси- и 12-липооксигеназного путей не обладали таким эффектом. После обработки арахидоновой кислотой опухолевые клетки интенсивно продуцировали эйкозатетраеноиды (5-HETE) – активные метаболиты 5-LOX, поддерживающие клеточную пролиферацию (Ghosh, Myers, 1997). В другой работе бестимусных мышей содержали на диетах с высоким содержанием жиров (210 г/кг), обогащённых кокосовым, оливковым, сафлоровым маслами и рыбьим жиром. Диета с низким содержанием жиров (25 г/кг) служила контролем. По сравнению с последней опытная диета (кроме рыбьего жира) значительно увеличивала размер опухоли у мышей, которых содержали на ней 3 нед. до перевивки им клеток НТ29 опухоли толстой кишки человека. Авторы, предста-вившие эти данные (Calder et al., 1998), полагают, что PUFAs-6 участвуют в инициации опухолевого роста, но не влияют, правда, на уже возникшую опухоль толстой кишки.

Исследования на женщинах (61471 человек, возраст 40-76 лет) показали: PUFAs увеличивали риск развития рака молочной железы на 69 %, насыщенные же жиры не связаны с таким риском (Soran, 1998). Потребление PUFAs повышает также риск возникновения и доброкачественных опухолей, в частности яичника. Это вытекало из результатов анализа данных 746 больных с такими опухолями и 404 контрольных лиц (Britton et al., 2000).

Указанным выше фактам, казалось бы, противоречат некоторые сведения о противоположном, т.е. антибластомном действии PUFAs. Обнаружено, в част-ности, что эти кислоты убивают культивируемые клетки рака молочной железы, лёгких и простаты человека, причём при концентрациях, не оказывающих пов-реждающего эффекта на нормальные фибробласты и эпителиоциты. При сов-местном культивировании нормальных и опухолевых клеток в среде, не содержащей PUFAs, росли преимущественно опухолевые клетки. После же добав-ления эйкозапентаноевой, линоленовой или арахидоновой кислот, напротив, наблюдали преимущественный рост нормальных клеток. Наиболее селективный цитотоксический эффект проявляли кислоты с тремя, четырьмя и пятью двойными связями (Begin et al., 1985). Ингибирующее воздействие указанных кислот показано и на клетках гепатомы человека (HepG2), причём уровень ПОЛ в клетках и эффект ингибирования возрастали при увеличении в PUFAs двой-ных связей. Добавление альбумина в концентрации 0.7-5 % или витамина Е оказывало защитное действие (Horstmark, Lystad, 1992). По-видимому, известная гипероксия в среде культивирования, неестественная для жизни неадаптировавшихся к ней клеток, приводит к ещё большему возрастанию рО₂ и уровня свободнорадикальной пероксигенации в опухолевых клетках, которые и до этого в условиях in vivo представлялись в них повышенными. В такой ситуации обеспечить опухолевые клетки достаточным количеством легко окисляемых PUFAs – значит создать настолько сильные пероксигеназные условия, что они способны селективно уничтожить именно эти клетки.

Подобного мнения придерживаются и другие исследователи, считая, что повышенное содержание PUFAs в мембранах опухолевых клеток усиливает в них процесс перекисного окисления, увеличивает концентрацию свободных радикалов, обладающих цитотоксическим действием на эти клетки и их предшественников (Begin et al., 1988; Gower, 1988). К числу фактов такого же рода относятся и следующие. Введение в клетки гепатомы арахидоновой кислоты приводит их к гибели (Canuto et al., 1991). Инкубация с той же кислотой (100 мкМ) клеток гепатомы Морриса значительно усиливает ПОЛ и также ведёт к их смерти (Takeshige et al., 1997). А изучение цитотоксического действия PUFAs на культуру макрофагоподобных раковых клеток АК-5 обнаружило активацию PLC, усиление образования диацилглицерина и повышение активности PKC указанными кислотами. Они же снижали активность протеинкиназы А и уровень cAMP (Padma, Das, 1999). Последние два эффекта могут быть результатом инактивации мембраносвязанной и фосфолипидозависимой аденилатциклазы вследствие развития в названных выше условиях избыточного ПОЛ и разру-шения липидного микроокружения фермента. Низкое же содержание cAMP усугубляет недостаточность митохондриального дыхания опухолевых клеток, в норме стимулируемое данным циклонуклеотидом (см. п. 2.1.9), и это обстоятельство должно усиливать пероксигеназный цитотоксический эффект PUFAs.

Некоторые жирные кислоты, будучи антиоксидантами, напротив, могут in vivo тормозить свободнорадикальные процессы окисления при канцерогенезе и, следовательно, образование неоплазм. Так, смесь конъюгированных диеновых изомерных производных линолевой кислоты снижает на 50 % индукцию опу-холей преджелудка мышей бенз(а)пиреном. Выяснилось, что эти соединения включаются в липиды тканей и проявляют антиоксидантную активность, являясь ловушкой атомарного кислорода (Ha et al., 1989). На способность PUFAs действовать как антиоксиданты и защищать от оксидативного стресса, индуци-рованного другими PUFAs, указывают и Такешиге с соавт. (Takeshige et al., 1997). Возможно, антиоксидантным эффектом обладают прежде всего мононенасыщенные жиры, которые в отличие от PUFAs оказывали защитное действие против рака молочной железы у женщин (Soran, 1998). Отметим также работу (Денисов и др., 1992), где особенно выделяются материалы о роли рыбьего жира: включение его в диету животных замедляет рост опухолей, а эпидемиологическими исследованиями выявлена обратная зависимость между количеством потребляемого рыбьего жира и заболеваемостью раком молочной железы.

Любой из указанных выше исходов будет зависеть, очевидно, от соотноше-ния концентраций участвующих в биохимических реакциях субстратов окисления, про- и антиоксидантов. В этой связи интересны также выводы по результатам изучения анти- и прооксидантного действия фосфолипидов и возможного присутствия здесь противоречия. В опытах in vitro было установлено, что фос-фолипиды проявляют себя как антиоксиданты при добавлении к быстроокис-ляющемуся субстрату и, наоборот, как выраженные прооксиданты в случае медленноокисляющегося субстрата. На этом основании рещающим фактором в определении анти- или прооксидантного эффекта фосфолипидов на окисление различных субстратов считают окисляемость самих фосфолипидов по отношению к окисляемости соответствующего субстрата (Бородин и др., 1997).

Таким образом, повышение или снижение уровня ПОЛ при изменении содержания PUFAs может соответственно интенсифицировать или ингибировать процессы роста и метастазирования опухолей (De Vries, Van Noorden, 1992), в случае же возрастания дисбаланса ∆ (ПО – АО) в их клетках до цитолизных значений новообразования с такими клетками подвергаются регрессии. На принципах избирательного создания в опухолевых клетках антиоксидантной или пероксигеназно-лизисной ситуаций основаны эти два вида лечебных воздействий прямо противоположного характера (Лю, Шайхутдинов, 1991). По отношению же к нормальным клеткам вызываемое PUFAs усиление ПОЛ нередко заканчивается возрастанием в них дисбаланса ∆ (ПО – АО) с низких значений до ∆_К (ПО – АО), т.е. созданием необходимых условий для канцерогенеза (см. п. 1.1.1, 1.6.1, 7.1.1). При таком понимании механизма феномен двойственной роли АФК и пероксигенации липидов, обсуждаемый исследователями лишь на уровне констатации (Gonzalez, Riordan, 1996), не является парадоксальным.

2.3.2. Образующиеся в плазматической и других мембранах перекиси липидов в норме выполняют ряд необходимых и важных для клетки функций (см. п. 2.1.10). К числу последних следует отнести ещё и активацию гуанилатциклазы, увеличение в клетке концентрации cGMP, который, как давно извес-тно, в противоположность cAMP индуцирует синтез ДНК и пролиферацию различных клеток. Стимуляция митогенами практически всегда увеличивает уровень cGMP в клетках, а высокое содержание его, как правило, характерно для клеток с большой скоростью пролиферации (Федоров, 1979). Возникновению и реализации стимулирующего эффекта перекисями способствует само фосфолипидное микроокружение мембранных гуанилатциклаз, в том числе связанных с мембранами митохондрий и микросом. О₂-зависимая активация гуанилатциклазы (White et al., 1982) в гипероксических условиях опухолевой клетки должна приводить и к увеличению содержания cGMP. Последующими этапами в данной цепи управления могут быть: повышение активности cGMP-зависимых протеинкиназ – усиление фосфорилирования каких-то конкретных ядерных белков, в частности, гистона Н1 – образование необходимых условий для синтеза и репликации ДНК. К числу активаторов гуанилатциклазы относят арахидоновую кислоту и продукты её метаболизма – гидроксиэйкозатетраеновые и гидропероксиэйкозатетраеновые кислоты. Полагают (Кухарь и др., 1991), что именно эти метаболиты являются основным фактором сопряжения полифосфоинозитид-зависимого процесса передачи сигнала (см. п. 3.1) с активацией гуанилатциклазы и повышением уровня cGMP в клетке.

Давнее исследование молекулярных механизмов активации гуанилатцик-лазы на примере её молекулы, связанной с мембранами миометрия матки крысы, показало, что гидроперекиси липидов могут взаимодействовать с регуляторными гидрофобными участками гуанилатциклазы (Leiber, Harbon, 1979). Авторы другой работы того периода (Graff et al., 1979) установили: гидроперекиси ненасыщенных жирных кислот стимулируют растворимую гуанилатциклазу из селезёнки морских свинок путём окисления SH-групп, находящихся в специфических гидрофобных центрах этого фермента.

Известное свойство оксида азота стимулировать гуанилатциклазу (Denninger, Marletta, 1999; Moncada, 2000; Artz et al., 2001; Davis et al., 2001) позволило постулировать свободнорадикальный механизм поддержания повышен-ного уровня cGMP в активно растущих участках неоплазмы. Ранее было установлено (Козлова, 1975), что в гипоксических зонах опухолей спонтанно образуется оксид азота по схеме NO‾₃ → NO‾₂ → NO. Источником NO являются нитриты, которые попадают в организм с пищей и содержатся в тканях в довольно больших количествах (до 10‾³ М). Необходимый фактор для проявления и накопления NO – анаэробные и восстановительные условия, характерные для внутренних участков опухолей. NO образует с гемоглобином, негемовым железом и цитохромами нитрозильные комплексы, обусловливающие триплетный сигнал в опухолях. Такие сигналы наиболее интенсивны в некротизированных участках опухолей и наиболее слабы в активно пролиферирующих их зонах. Часть NO из гипоксических участков неоплазмы может, очевидно, диф-фундировать в клетки периферийной, т. е. гипероксической зоны, где и под-держивает активность гуанилатциклазы, предположительно, по свободноради-кальному механизму. Ведь NO благодаря наличию неспаренного электрона на внешней π-орбитали обладает высокой реакционной способностью и является свободнорадикальной молекулой, играющей роль многофункциональной моле-кулы-мессенджера и предназначенной, в частности, для повышения содержания cGMP в клетках-мишенях (Davis et al., 2001; Серая, Нарциссов, 2002).

Неферментативные пути образования NO в принципе возможны и в самих гипероксических опухолевых клетках. На вероятность такого события в условиях повышенных уровней АФК указывают два следующих сообщения. Согласно одному из них (Nagase et al., 1997), в отсутствие NO-синтетазы зафиксировано образование NO в результате взаимодействия Н₂О₂ с D- или L-аргинином. Во второй же работе показана возможность в присутствии О неферментативного синтеза NO из N^G-гидрокси-L-аргинина – промежуточного соединения в реакции образования NO из L-аргинина, катализируемой синтетазой NO, т.е. по механизму, реализуемому в фагоцитирующих клетках в усло-виях окислительного (дыхательного) «взрыва» (Modolell et al., 1997). Наконец, продукция NO в опухолях человека возрастает непосредственно из-за увеличе-ния экспрессии и активности изоформ синтетазы NO (Ambs et al., 1997), а также за счёт, по-видимому, условий гипероксии: синтез NO требует присутствия молекулярного О₂, при дефиците которого роль NO-синтетазного механизма может снижаться (Реутов, Сорокина, 1998).

Интересны данные об изменении после очистки гуанилатциклазы дозовой зависимости её стимуляции оксидом азота: частично или полностью очищенная гуанилатциклаза активировалась меньшими дозами NO, чем находившаяся в гомогенате (печени крыс). Возможная причина увеличения чувствительности фермента к более низким концентрациям NO – очистка от гема, белков и низкомолекулярных веществ, которые могут захватывать NO и препятствовать избыточному окислению гуанилатциклазы (Braughler et al., 1979). Считают, что механизм действия NO состоит в связывании с Fe гемовых групп, приводящее к изменению конформации белков-ферментов, в том числе гуанилатциклазы (Cooper, 1999; Halliwell, Gutteridge, 1999; Artz et al., 2001). Последнюю стимули-рует не только сам оксид азота, но и парамагнитные комплексы его с гемопротеидами – NO-Hb, NO-каталаза, NO-цитохром Р-450 (De Rubertis et al., 1980).

Значение нитрозил-гемового комплекса, возникающего при взаимодействии гема гуанилатциклазы с NO, и роль SH-групп этого циклонуклеотида в его активации подробно обсуждаются в работе Севериной (1998). Она же и соавт. (Северина и др., 2000) впервые показали, что селективным ингибитором NO-зависимой активации растворимой гуанилатциклазы является карнозин, взаимодействующий с Fe гема. Это свойство карнозина рекомендовано ими использовать для подавления в клетке сигнальной системы NO - растворимая гуанилатциклаза - cGMP, когда содержание последнего, в частности, в злокачественных опухолях резко возрастает. Учитывая, однако, что карнозин – антиоксидант, скавенджер свободных радикалов (Hipkins, 1998), он может быть представлен просто как ингибитор свободнорадикального механизма активации гуанилатциклазы.

Способность NO, образующегося из L-аргинина в макрофагах, клетках эндотелия сосудов, центральной нервной системы и других тканей, активировать гуаннилатциклазу, с одной стороны, и ингибировать дыхательные ферменты, в частности, цитохромоксидазу в конкуренции с О₂ (Koivisto et al., 1997; Giulivi, 1998; Brookes et al., 1999; Murphy, 1999; Torres, Wilson, 1999; Moncada, 2000), с другой, может объяснить отмечаемую в некоторых работах двойственность поведения NO в отношении митогенеза нормальных клеток. Промитогенное действие NO определяется, по-видимому, проявлением обоих указанных эффектов, увеличивающих продукцию cGMP и дисбаланс ∆ (ПО – АО) до необходимых для окислительного митогенеза значений; антимитогенное же действие NO может быть связано со снижением им дыхания клетки сверх опре-делённого уровня, т. е. конечный результат будет зависим от соотношения активностей индуцируемых NO сигнальных путей.

Второй из рассмотренных выше исходов соответствует, вероятно, описанному в работе Гарга и Хассида (Garg, Hassid, 1989). Здесь сосудорасширяющие агенты (нитропруссид натрия и др.), генерирующие оксид азота, подавляли стимулированную сывороткой пролиферацию мезангиальных клеток крысы. Данный эффект авторы объясняют лишь повышением в клетках уровня cGMP, который, по их мнению, может служить внутриклеточным медиатором антимитотического действия NO. Иной результат получен и в другой работе (Kuzin et al., 1996), где показано, что ингибирование продукции NO стимулирует проли-ферацию, а увеличение – ускоряет последнюю. Такая направленность действия связи NO – cGMP определяется, возможно, данными (относящимися, правда, к тромбоцитам) о том, что cGMP тормозит активацию PLC и PLA₂ (Северина, 1998). Если это представление верно по отношению и к другим типам клеток, то следствием его должна быть заторможенность полифосфоинозитидной сиг-нальной системы, в том числе и LOX-пути метаболизма арахидоновой кислоты как составного компонента процесса активации пролиферации клеток.

Двойственность действия NO, как оказалось, проявляется и в отношении канцерогенеза (см. обзоры: Винк и др., 1998; Тейлор и др., 1998). В одних случаях NO, проявляя цитотоксическое действие на многие типы опухолей, выступает как важный фактор защиты организма от рака (Xie et al., 1995), интегральная часть противоопухолевой иммунной защиты (Винк и др., 1998), а в других – как активатор развития неоплазм (Jenkins et al., 1995), составная часть способствующих их росту механизмов (Винк и др., 1998). Соотношение защитных и цитотоксических эффектов NO в определённой мере будет зависеть от внутриклеточного редокс-статуса (Тейлор и др., 1998). А по мнению Винка и соавт. (1998), указанная двойственность определяется количеством синтезированного NO и тем, на какой стадии развития опухоли действует NO. В общем случае, с учётом негативного влияния NO на митохондриальное дыхание и, сле-довательно, на внутриклеточный дисбаланс ∆ (ПО – АО), исход действия NO на процесс канцерогенеза должен, как мы полагаем, определяться прежде всего параметрами указанного дисбаланса. Устойчивое поддержание его в диапазоне ∆_К (ПО – АО) можно рассматривать как необходимое условие для роста неоп-лазм. При значениях же этого дисбаланса, отвечающих диапазону ∆_Ц (ПО – АО) и выше, неминуем окислительный цитолиз опухолевых клеток (см. п. 1.1.2).

Кстати, способность NO повышать радиочувствительность клеток млекопитающих в условиях гипоксии (Mitchell et al., 1993), в том числе раковых клеток в гипоксических зонах неоплазм (Винк и др., 1998), должна вызывать интерес как следствие, в первую очередь, ингибирования оксидом азота митохондриального дыхания (потребления О₂). Накопление за счёт этого О₂ внутри клеток приводит к некоторому возрастанию рО₂ – основного фактора, определяющего в соответствии с известным в радиобиологии кислородным эффектом радиочувствительность клеток и тканей.

Следует также иметь в виду, что в ряде работ повышение уровня cGMP в пролиферирующих и, в частности, опухолевых клетках объясняется не только активацией гуанилатциклазы, но и снижением активности фосфодиэстеразы cGMP. Об этом сообщили, например, Антоненко с соавт. (1990), исследуя роль системы циклических нуклеотидов на поздних стадиях химического гепатоканцерогенеза. Поскольку в указанных клетках одновременно уменьшается содержание cAMP, низкое значение принимает и соотношение cAMP/cGMP. В связи с этим просматривается функционирование в клетках некоторой триггерной системы, осуществляющей автоматическое переключение по логике: снижение уровня cAMP – повышение уровня cGMP с быстрым обеспечением низкого соотношения cAMP/cGMP в активно пролиферирующих клетках; напротив, в дифференцирующихся в специализированные клетках это переключение сра-батывает в обратную сторону, быстро приводя к высокому соотношению cAMP/cGMP. С учётом же того, что известны факты возрастания гидролиза cAMP под действием cGMP и, наоборот, гидролиза cGMP под действием cAMP, т.е. использования триггерного принципа для реализации альтернативных фун-кций этих циклонуклеотидов, возможен ещё один дополнительный путь поддержания в активно растущих зонах опухолей пероксигеназного состояния: NO – активация гуанилатциклазы – повышение уровня cGMP – снижение кон-центрации cAMP – падение интенсивности митохондриального дыхания – воз-растание внутриклеточных рО₂ и ПОЛ. Конкретные схемы реализации ука-занного принципа регуляции на биохимическом уровне могут быть составлены уже сейчас по известным в литературе отдельным фактам.

Какие-то новые регуляторные возможности NO открываются в связи с тем, что это соединение, как было установлено (Lander et al., 1995), активирует продукт р21 протоонкогена ras, играющего важную роль в трансформации внеклеточных сигналов во внутриклеточные биохимические процессы. Акти-вация носит непосредственный и обратимый характер и обусловлена нитрози-лированием специфичного остатка Gys в онкобелке, влияющего на гуанино-нуклеотидный обмен. Следует также иметь в виду, что к числу продуктов неферментативных реакций NO относятся постоянно образующиеся в самом организме канцерогенные нитрозамины (Голубев, 1996). И, наконец, обратим внимание на следующие принципиальные факты. Взаимодействие возникающих в опухолевых клетках АФК и NO приводит к образованию, в част-ности, сильнейшего прооксиданта пероксинитрита. Последний же, как впервые показано в глиомах человека, опосредует нитрозилирование и агрегацию опухо-левого супрессора р53. Такие посттрансляционные модификации должны быть существенными для инактивации функций этого онкобелка при канцерогенезе и ряде других патологических процессах (Cobbs et al., 2001).

2.3.3. В ростстимулированных и малигнизированных клетках, как известно, значительно возрастает активность орнитиндекарбоксилазы (ODC) и S-адено-зил-L-метиониндекарбоксилазы (AMDC) – ключевых ферментов синтеза полиаминов, играющих важную роль в синтезе и функционировании нуклеиновых кислот и белков. В результате в опухолевой ткани и биологических жидкостях (кровь, моча, спинномозговая жидкость) онкобольных повышается содержание свободных полиаминов (Sicca et al., 1997). Например, определение их уровня в тканях опухолей молочной железы (100 чел.) и тканях фиброаденом (30 чел.) показало, что он существенно выше в злокачественных тканях, чем в доброка-чественных. Содержание полиаминов коррелировало с высоким митотическим индексом, метастазами в лимфатических узлах и гистологическими парамет-рами опухоли (Leveque et al., 1999).

Постоянный и значительный рост уровня ODC свидетельствует о вероятной специфической роли этого фермента в активной клеточной пролиферации и, в частности, в процессе онкогенеза (Березов, 1993). Интересны, например, такие факты. При доброкачественной гиперплазии простаты содержание в ткани железы полиаминов путресцина, спермидина и спермина повышено по сравне-нию с их содержанием в нормальной простате соответственно в 2,2, 3,4 и 6 раз; активность ODC увеличена в 3,2 раза, причём это связано со сверхэкспрессией мРНК ODC в поражённой простате (Liu X. et al., 2000). Трансформация клеток NIH-3T3 мыши активированными онкогенами H-Ras и RhoA сопровождается стимуляцией экспрессии в этих клетках ODC, уровень которой коррелирует с процессом перехода клеток в злокачественную форму. Как установили авторы (Shanz, Pegg, 1998), «котрансфекция этих клеток трансгеном ODC с доминантно-негативной мутацией приводит к реверсии опухолевого фенотипа», и это доказывает причинную связь онкогенеза с активацией экспрессии ODC. У крыс с опухолегенезом ободочной кишки, индуцированным 1,2-диметилгидра-зином, в слизистой её ткани выявлен повышенный уровень активности ODC, который более высоким был в опухолях. В последних под действием канце-рогена постепенно возрастало содержание спермидина, спермина и особенно путресцина (Shigesawa et al., 1998).

По многочисленным данным (Meyskens, Gerner, 1995; Loser et al., 1996; Lin et al., 1997; Fong et al., 1998), α-дифтор-метилорнитин (DFMO), ингибитор ODC, и метилглиоксаль-бис-гуанилгидразин, ингибитор AMDC, вызывают быстрое уменьшение внутриклеточного уровня полиаминов и активности ДНК-полиме-разы, снижение пролиферации клеток и подавление роста самых различных типов неоплазм. DFMO ингибирует ODC необратимо, образуя с ней прочные связи по Cys 360 и Lys 69 (Pegg et al., 1995). Кроме того, DFMO обладает антиангиогенезным и проапоптозным действиями, а также ингибирует рост опухоли и метастазов на модели рака желудка человека (Takahashi et al., 2000). На такой же модели показано, что DFMO останавливает клеточный цикл в фазе G₁ независимо от р53 в течение 48-72 ч после введения его в культуру клеток рака желудка (Nemoto et al., 2001). Другой ингибитор ODC, 1,3-диаминопро-пан, также проявляет противоопухолевый эффект. Это было показано на при-мере крыс линии F344, которым в течение 4-х нед. давали с питьевой водой канцероген N-бутил-N-(4-гидроксибутил)нитрозамин (доза 0.05 %). Указанный ингибитор (доза 2.0 г/л) значительно снижал размер опухолей мочевого пузыря, их количество и частоту возникновения (Salim et al., 2000).

С точки зрения развиваемой нами концепции представляют интерес давние сведения (Russel et al., 1981), по которым сАМР или дибутирил-сАМР проявляют себя как факторы, снижающие, в частности, активность ODC. При низком содержании сАМР в трансформированных и опухолевых клетках его ингибирующее действие будет, очевидно, ослаблено, и активность ODC должна соответственно возрастать. А недавно было сообщено, что биосинтез полиаминов находится под контролем клеточной энергетики. Как оказалось, модуляторами активности ODC являются адениловые нуклеотиды, причём АТР показал себя более сильным ингибитором ODC из печени мышей и клеток карциномы Эрлиха, чем ADP (Бердинских и др., 1999). В опухолевых клетках, отличающихся сниженным уровнем АТР, активность ODC должна повышаться и по этой причине. Таким образом, АТР и сАМР действуют в одном направлении, и это, возможно, связано с тем, что АТР –исходный продукт для образования сАМР (см. п. 2.1.9). По-видимому, полиаминовый канал управления пролиферацией может функционировать в виде локального контура регулирования с положительной обратной связью, так как сами полиамины тоже способны снижать уровень сАМР и одновременно повышать уровень cGMP (Clo et al., 1984).

Важно, что активность ODC увеличивается и в условиях гипероксии, без воздействия какого-либо опухолевого промотора, существенно повышая концентрацию полиаминов и синтез ДНК (Hacker et al., 1983). Процесс индукции ODC протекает с участием активированного О₂ и (или) свободных радикалов. Об этом косвенно свидетельствует дозозависимое угнетение активности эпидермальной ODC липофильными фенольными антиоксидантами. Активацию ODC и стимуляцию синтеза ДНК вызывали также гидроперекиси жирных кислот. Это было показано, например, в экспериментах in vivo на слизистой толстой кишки крыс при введении раствора указанных гидроперекисей в концентрациях до 10 мМ (Bull et al., 1984). На причастность АФК к активации ODC указывают и данные, приведённые недавно в обзоре Букина и Драудин-Кры-ленко (2000). Так, назначение больным природных антиоксидантов приводило к подавлению аномально высокой активности ODC и регрессии предопухолевых изменений слизистой желудка. Полагают, что эти и некоторые другие факты подтверждают высокий онкогенный потенциал ODC при её конститутивной суперэкспрессии, в частности при гастроканцерогенезе.

О месте расположения ODC в клетке до недавнего времени не было известно. Вероятно, она, как и большинство других ферментов, связана с какой-либо мембраной, скорее всего с клеточной. И действительно, в Т-лимфоцитах и неко-торых других клетках ODC оказалась ковалентно связанной с цитоплазмати-ческой поверхностью мембраны через фосфоинозитиды. Считают, что в норме, т.е. при взаимодействии рецепторов с лигандами (митогенами, стимуляторами), «включается» PLC, специфичная к фосфоинозитидам. Распад последних при-водит к быстрому освобождению и активации ODC (Mustelin et al., 1987). В условиях же гипероксии и пероксигенации эта акция может, по-видимому, индуцироваться изнутри клетки неферментативным путём, непосредственно. Гетерогенность ODC позволяет думать, что по такому механизму активируется какая-то определённая её изоформа. А по ещё одной версии (Sumiyoshi, Baer, 1991) специфическим изоферментом ODC, связанным с опухолеродностью (в данном случае толстой кишки) и ростом опухоли, является фосфорилированная его изоформа, которая соответствует второму, меньшему из двух хроматографических пиков активностей ODC. Эксперименты в этой работе были связаны с исследованием изоформ ODC в опухолях толстой кишки человека и в процессе индуцированного химического канцерогенеза толстой кишки у мышей.

С учётом роли ODC в активации пролиферации и опухолевой трансформации клеток естественны попытки исследователей найти пути дестабилизации ODC-зависимых сигнальных каналов. Определённые возможности на этот счёт вытекают из рассмотренных выше материалов. Это, прежде всего, использо-вание ингибиторов ODC, различных антиоксидантов и некоторые другие. Любопытны данные о подавлении роста клеток меланомы человека интерлей-кином-1 (IL-1), действие которого также опосредованно снижением активности ODC (Yang D. et al., 1997). IL-1 не влияет на уровень экспрессии гена ODC, но приводит к снижению содержания и активности ODC в клетках меланомы, причём это действие IL-1 было вызвано тем, что он индуцировал на уровне транскрипции экспрессию антифермента ODC – белка, регулирующего активность и уровень ODC в клетке. Данный эффект антифермента ODC может быть блокирован введением в клетку его антисмысловой РНК. Этот интересный факт свидетельствует о том, что в единой системе функционирования клеточного генома задействована, в дополнение ко многим уже известным, ещё одна подсистема, имеющая отношение к регуляции клеточного цикла. Подобные «находки» будут, очевидно, продолжаться ещё долго, практически бесконечно, подтверждая сверхсложность программ реализации биохимических и регуляторных процессов в клетке.

Другой причиной повышения уровня полиаминов в опухолевой клетке считают инактивацию мембраносвязанных аминооксидаз (Сяткин, Березов, 1982; Linsalata et al., 1997), которые, напомним, в норме катализируют реакцию окислительного дезаминирования многих низкомолекулярных азотистых сое-динений:

R-CH₂-NH₂ + O₂ + H₂O → R-CHO + NH₃ + H₂O₂,

где R – жирно-ароматические или алифатические радикалы. Например, в гепатомах по сравнению с печенью значительно уменьшается или даже исчезает липидозависимая активность митохондриальной моноаминооксидазы (МАО). Модифицируя фосфолипидный состав опухолевых митохондрий с помощью липидобменивающих белков, удаётся приблизить его к норме и тем самым восстановить активность указанной оксидазы (Бергельсон, 1984). В ткани рака желудка у людей активность МАО была ниже, чем в контроле, причём различия активности в ткани полипов и контроле были менее выражены, чем между раком желудка и контролем (Odegaard et al., 1986). Ниаламид как ингибитор МАО оказывал стимулирующее действие на канцерогенез, индуцированный N-метил-N′-нитро-N-нитрозогуанидином у крыс Wistar. Вводимый ежедневно в течение 26 нед по кожу в дозе 50 мг/кг, ниаламид увеличивал как частоту возникновения, так и количество раковых опухолей желудка в его железистом отделе. Он повышал также клеточную пролиферацию в желудочном эпителии, с чем и связывают промоторный эффект ниаламида (Tatsuda et al., 1989).

Аналогичная информация имеется в литературе и в отношении диаминооксидазы (ДАО). Так, в печени крыс при гепатоканцерогенезе, индуцированным N-нитрозодиэтиламином, снижается активность ДАО и увеличивается вну-триклеточное содержание полиаминов. Наиболее выражены эти изменения в первый месяц канцерогенеза и в опухоли (Бердинских, Лялюшко, 1987). Ингибирование ДАО в слизистой толстой кишки крыс аминогуанидином стимулирует образование опухолей толстой кишки. В этих новообразованиях активность указанного фермента была существенно ниже, чем в неизменённой слизистой крыс. На основании этих данных ДАО приписывается антипролиферативная функция (Kusche et al., 1989).

Следует отметить, что МАО, катализируя окислительное дезаминирование биогенных аминов, способна при определённых условиях индуцировать в ходе этой реакции и процесс перекисного окисления мембранных фосфолипидов. ПОЛ протекает в непосредственном микроокружении мембраносвязанной МАО, что может быть существенным механизмом трансформации данного фер-мента (Каган и др., 1984а). При этом снижение активности МАО возможно по двум разным причинам: 1) вследствие нарушения при ПОЛ необходимого для функционирования фермента липидного микроокружения; 2) из-за инактивации фермента непосредственно АФК, образующимися при окислении аминов, радикальными и молекулярными продуктами ПОЛ. В первом случае в наружной мембране митохондрий возможно функционирование в норме следующей локальной периодически действующей системы регуляции: «включение» липидозависимой МАО → окислительное дезаминирование аминов → индуцирование процесса ПОЛ мембран → «выключение» МАО. После восстановления исходного липидного окружения фермента циклическая работа системы может пов-торяться. Подобные локальные системы регуляции действуют, вероятно, и в других мембранах, но на «базе» иных ферментов. Вообще же, изменение каталитических свойств МАО обнаружено при многих патологических состояниях, характеризующихся стимуляцией процессов ПОЛ. Окислительная модификация МАО связана с окислением её SH-групп и приводит к увеличению чувствительности фермента к ограниченному протеолизу (Медведев, Типтон, 1997).

Очевидно, чувствительность каждой из множественных форм МАО к действию инактивирующих факторов различна в зависимости от своей специфичности и состава липидного микроокружения. В этой связи интересны данные о предшествующей канцерогенезу индукции МАО-В 17β-эстрадиолом в почках хомячков. Полученные результаты показывают, что опосредуемая через рецепторы эстрогенов активация МАО в почках значительно усиливает продукцию Н₂О₂ при окислительном дезаминировании биогенных аминов (см. выше) и гидроксилирование радикалов, с которыми связывается индукция опухолевого роста (Sarabia, Liehr, 1998). По-видимому, в данном конкретном случае образующиеся в реакциях дезаминирования АФК не приводят к заметному (значимому) снижению активности МАО В-формы, но для близлежащих нормальных клеток они представляются канцерогенным фактором. Кстати, причастность к указанным процессам эстрадиола, возможно, указывает на один из путей реализации дисгормонального канцерогенеза.

Не менее привлекательны и следующие факты. В клетках НЕК 293 эмбри-ональной почки человека, стабильно трансфицированных кДНК МАО-В, пос-ледняя индуцировала митогенез посредством образования в клетках Н₂О₂. Тирамин (субстрат МАО-В) через ряд промежуточных процессов усиливал синтез ДНК в экспрессирующих МАО-В клетках НЕК 293. Данный эффект тирамина полностью предотвращался предобработкой клеток ингибитором МАО паргилином или антиоксидантом N-ацетилцистеином (Vindis et al., 2000). Эти материалы свидетельствуют, вероятно, о том, что прооксидантное действие МАО-В в данном случае не приводит к «канцерогенезному» дисбалансу ∆_К (ПО –АО), ограничиваясь значениями в более низком, «пролиферативном» диапазоне ∆_П (ПО – АО). До этого же сообщалось о причастности митохондриальной МАО-В к феномену ускоренного пероксидативного старения мышей (Юнаева и др., 1998). Согласно другой информации, возникающая во внешней мембране митохондрий при участии МАО перекись водорода способна, как и образующаяся во внутренней мембране при функционировании дыхательной цепи, к окислительному повреждению мтДНК (Poderoso et al., 1998). В таком случае в принципе возможен ещё один вариант индукции кислородно-перекисного механизма канцерогенеза – аминооксидазно-митохондриальный.

Тем не менее, при ПОЛ мембран, особенно при его избыточности и непрерывности в связи с внутриклеточной гипероксией, активность аминооксидаз должна в большинстве случаев заметно снижаться, вызывая соответствующее увеличение уровня полиаминов. Более того, Сяткин и Березов (1982) на при-мере гепатоканцерогенеза показали, что ранние и существенные изменения (утрата) активности ДАО способствуют росту уровня полиаминов в большей степени, чем возрастание ODC. Позднее Березов (1993) представил иной результат: при канцерогенезе скорее индуцируется синтез ODC, чем стимулируется исходная энзиматическая активность. Индуцируемый синтез ODC рассматривается им в качестве не только раннего, но, возможно, и обязательного биохимического признака любого гиперпролиферативного процесса, включая канцерогенез. Сходное мнение высказали Пегг и соавт. (Pegg et al., 1995). По их данным, в клетках NIH 3T3 сверхэкспрессия ODC переводит их в неопластическое состояние. В возможной роли онкобелка ODC рассматри-вается как мишень для химиопрофилактики рака.

Другого мнения придерживаются Бердинских и соавт. (1990). Изучая содержание полиаминов в слизистой оболочке тонкого и толстого кишечника крыс при канцерогенезе, индуцированном 1,2-диметилгидразином, они уста-новили иной «расклад». Возрастание уровня полиаминов в опухолевой ткани определялось как активацией их синтеза, так и ослаблением катаболизма (снижением активности ДАО). Однако первичная и более значительная роль в изменении синтеза и содержания полиаминов отводится ими повышению активности ODC. В одной из последующих работ (Балицкая и др., 1992) они подтвердили факт увеличения содержания полиаминов по указанным двум механизмам на этот раз в ткани злокачественных лимфом по сравнению с гиперплазированными и нормальными лимфатическими узлами у детей. Наряду с повышением активности ODC в тканях лимфом (в 15-20 раз выше, чем в контроле), уровень окислительного дезаминирования путресцина и спермидина в них был ниже, чем в нормальных и гиперплазированных лимфоузлах. А в тканях неходжкинских лимфом выявлены минимальная аминооксидазная и мак-симальная ODC-активности. Но в любом случае за накопление полиаминов в опухолевой клетке ответственны, на наш взгляд (см. выше), устанавливающиеся в ней гипероксические и, следовательно, пероксигеназные условия.

Механизмы участия полиаминов в синтезе нуклеиновых кислот пока не известны. Один из них может иметь отношение к ADP-рибозилированию ядерных белков, поскольку спермин и спермидин как акцепторы ADP-рибозных единиц при связывании последних тормозят, в частности, рибозилирование гистона Н1 (Faraone-Mennella et al., 1984). Наряду с такой модификацией ядерных белков, в литературе обсуждался и другой возможный механизм – повышение активности сперминозависимых протеинкиназ, которые путём фосфорилирования в ядре РНК-полимераз активируют эти ферменты и усиливают тем самым синтез РНК. Ещё одно представление возникло в связи с изменением картины фосфорилирования белков хроматина эндогенными полиаминозависимыми протеинкиназами. Эти данные рассмотрены с позиций участия полиа-минов в регуляции активности генов через селективное подавление фосфори-лирования одних и стимуляцию фосфорилирования других индивидуальных негистоновых белков хроматина (Hara et al., 1982).

Если иметь в виду конкретные гены, то полиамины оказались необходимыми для транскрипции, в частности, «пролиферативных» протоонкогенов c-myc и c-jun. Эти данные получены на примере эпителиальных клеток (линия IEC-6), выделенных из кишечника крысы. Ингибитор α-DFMO почти полностью истощал в этих клетках все полиамины и значительно уменьшал экспрессию c-myc и c-jun, в том числе стимулированную эмбриональной сывороткой крупного рогатого скота. Прямое же воздействие спермидина на ядра, выделенные из полиамин-дефицитных клеток, приводило к увеличению транскрипции c-myc и c-jun (Patel, Wang, 1997). По другой информации (Tabib, Bachrach, 1999), полиамины спермидин и путересцин усиливали в культуре клеток эпителия почки и фибробластов крысы экспрессию протоонкогенов c-fos и c-myc. С этим эффек-том связаны дерегуляция процесса пролиферации клеток и образование коло-ний в мягком агаре. Экспрессия протоонкогенов и стимуляция злокачественной трансформации клеток были дозозависимыми и более выражены при культи-вировании их в среде с путресцином.

2.3.4. Как известно, злокачественно трансформированные клетки характеризуются деструктивными изменениями элементов цитоскелета. В них почти полностью исчезают пучки микрофиламентов (Васильев, Гельфанд, 1981). Свиткина и Каверина (1989), изучая нарушение актинового цитоскелета в нео-пластически трансформированных эпителиальных клетках, отмечали как изменение спектра актинов и ассоциированных с актиновым цитоскелетом белков, так и нарушение отдельных структур этого цитоскелета. Неоднократно показано уменьшение количества и размера пучков актиновых микрофиламентов. Существенным изменениям при трансформации подвергается и эндоплазматический пласт микрофиламентов. Степень нарушения актинового цитоскелета коррелирует с такими изменениями морфологии, как разрушение межклеточных контактов, ухудшение распластанности клеток неоплазмы. Если в нетрансформированных клетках чётко прослеживается хорошо развитый комплекс микротрубочек, радиально расходящихся от центросферы к периферии, то в опухолевых этот комплекс или не определяется, или же микротрубочки имеют вид коротких, беспорядочно ориентированных волокон (Brinkley et al., 1977).

В клетках гепатомы, индуцированной у взрослых крыс диэтилнитрозамином, нити цитоскелета были повреждены, деполимеризованы и агрегированы. Однако после обработки шинифолином – препаратом из китайских трав система цитоскелета опухолевых клеток явно восстанавливалась и становилась подобной цитоскелету нормальных гепатоцитов (Wu et al., 1996). Микротрубочки в недифференцированных клетках рака прямой кишки человека представляли атипичную организацию, в них по сравнению с дифференцированными отсутствовали некоторые структурные и моторные белки или содержание их было низким (Chazaud et al., 1998). Клетки астроцитомы (линия SWO-38), в отличие от нормальных астроцитов, содержали значительно меньше микротрубочек, а большинство микрофиламентов формировали зерно- или корнеобразные актиновые тельца. Кроме того, микротрубочки и микрофиламенты имели тенденцию к сжатию (Yang C.-H. et al., 2001).

Изменения цитоскелета, подобные указанным, зафиксированы иммунофлуоресцентным методом в эпителиальных клетках человека HBL-100 в период опухолевой прогрессии (Decloitre et al., 1989). Эти клетки до 30 пассажей не являются опухолевыми, но приобретают свойства таковых при дальнейшем пассировании. Показано, что в нормальных клетках HBL-100 имелись как актиновые филаменты, так и микротрубочки, сконцентрированные около клеточ-ного ядра. По мере же увеличения числа пассажей актиновые филаменты выглядели всё более фрагментированными. После 70 пассажей указанные филаменты в клетках HBL-100 оказывались полностью дезорганизованными. Аналогичная картина наблюдалась и в клетках Т12, полученных из опухоли, которая была индуцирована введением бестимусным мышам пассированных более 70 раз клеток HBL-100. Однако сведения о том, что система микротрубочек в этих экспериментах выглядела более развитой, чем в нормальных клетках, не согласуются с материалами ряда других исследований, в том числе обсуждаемых в данном параграфе.

Признаки перестройки элементов цитоскелета и их деструкции отчётливо коррелируют с переходом клетки в стимулированное состояние. В связи с этим высказаны разные мнения о механизме прохождения митогенного стимула от плазматической мембраны к внутриклеточным структурам. Система фибрилл, скорее всего, способствует торможению, а не проведению стимулирующего сигнала, поскольку его прохождение нередко связывают именно с дестабилизацией элементов цито- и мембранного скелетов, целостная же структура их соответствует состоянию покоящихся клеток. Организованное внутриклеточное расположение микротрубочек и микрофибрилл изменяет их взаимодействие с геномом таким образом, что это подавляет способность клеток к размножению (Puck, 1977 – цит. по Епифановой и соавт., 1983).

Действительно, известные антитубулины колцемид и колхицин синергично увеличивают синтез ДНК в нормальных фибробластах ЗТЗ, стимулированный эпидермальным фактором роста, что прямо свидетельствует о связи этого синтеза с организацией микротрубочек Тот же колцемид в концентрации 1 мМ препятствовал морфологической реверсии трансформированных фибробластов яичников китайского хомячка, вызванной добавлением в среду культивирования 1 мМ дибутирил-cAMP и проявлявшейся, в частности, в развитии цитоскелета, появлении контактного торможения и снижении пролиферации (Bloom, Lockwood, 1980). По результатам работ, посвящённых зависимости прохож-дения клеточного цикла от состояния микротрубочек, был сделан вывод: разборка микротрубочек – необходимый этап, предшествующий синтезу ДНК и митозу (Thyberg, 1984). Более того, по некоторым данным (Bershadsky et al., 1995) для инициации синтеза ДНК достаточно разрушения небольшой доли клеточных микротрубочек.

В последующие годы факты, подобные указанным выше, приводились в литературе неоднократно. Показано, в частности, что антипролиферативный агент криптофицин в наномолярных концентрациях активно стабилизирует микротрубочки из тубулина мозга быка. В его присутствии угнеталось укорочение микротрубочек и почти прекращался процесс их распада. Предположительно, эффекты криптофицина в клетках-мишенях определяются его способностью активно связываться с концевыми участками микротрубочек (Panda et al., 1997). Позднее в этой же исследовательской группе (Panda et al., 2000) установлено, что в указанных выше концентрациях криптофицин ингибирует митоз и раковых клеток, стабилизируя микротрубочки веретена. Он быстро, некова-лентно и почти независимо от температуры связывается с тубулином в единственном высокоаффинном центре. При этом подавляется индуцируемая колхицином GTPазная активность тубулина, что отражает его структурную перест-ройку при связывании с криптофицином. Неслучайна также другая корреляция: белок статмин (метабластин, онкопротеин 18), препятствующий встраиванию тубулина в микротрубочки и вызывающий их разборку, найден во всех размножающихся клетках позвоночных, но особенно повышенная экспрессия стат-мина отмечена в лейкозных клетках (см. Надеждина, Зиновкина, 1999 и цитируемые ими работы).

Как растительный противоопухолевый препарат давно известен таксол, действие которого объясняется стабилизацией микротрубочек: взаимодействие его с основным их компонентом β-тубулином способствует полимеризации последнего, блокирует разборку микротрубочек и инициацию синтеза ДНК колхицином. Число сторонников установившегося мнения о таксоле как антипролиферативном агенте продолжает всё ещё расти (Axel et al., 1997; Giannakakou et al., 1997; Mullins et al., 1998; Preseisler et al, 1998 и др.). Небезынтересно, что таксол селективно ингибирует пролиферацию уже на уровне простейших внутриклеточных паразитов, например Leishmanio donovati – возбудителей вис-церального лейшманиоза из рода жгутиконосцев, приводя в опытах in vitro к дозозависимой сборке и стабилизации их микротрубочек (Kapoor et al., 1999). Эпотилоны – новый класс стабилизирующих микротрубочки агентов – обладает сходным с таксолом механизмом действия в отношении индукции полимеризации тубулина. Они вызывают остановку клеточного цикла на границе G₂-M (Bollag et al., 1995). А при исследовании механизма действия полусинтетичес-кого препарата таксорета, аналога таксола, на культуре клеток промиелоцитарного лейкоза человека установлено: таксорет сдвигает равновесное состояние тубулина в сторону образования микротрубочек, а также ингибирует их распад, что приводит к остановке клеток в метафазе. Однако на синтез ДНК, РНК и бел-ков и на активность топоизомераз I и II таксорет не влиял (Murata et al., 1996).

Паклитаксел (таксол) останавливал рост культивируемых миоцитов артериальной стенки человека, и этот эффект сохранялся при воздействии митогенов или при овместном культивировании миоцитов с эндотелиальными клетками артериальной стенки. По данным иммуногистохимического анализа, антипролиферативный ответ миоцитов – результат изменений в них, в основном, микротубулярной сети цитоскелета (Axel et al., 1997). Паклитаксел в концентрации до 10 нМ, значительно уменьшал рост плоскоклеточной карциномы гортани человека, индуцировал в комбинации с облучением (дозы до 3 Гр) мультиядерные клетки (Preseisler et al., 1998), и это, очевидно, происходит не без участия восстанавливаемого паклитакселем цитоскелета. Обработка клеток указанным агентом не приводила к их радиосенсибилизации, что также понятно: действия паклитакселя не направлены на повышение уровней рО₂ и ПОЛ и зависимого от них окислительного митогенеза. Элеутеробин – природный продукт, выделенный из морского коралла, вызывает в клетках карцином толстой кишки чело-века морфологические изменения, не отличимые от таковых при действии паклитакселя. Как и последний, элеутеробин индуцирует полимеризацию тубулина in vitro и гомогенную популяцию длинных, регидных микротрубочек, увеличивает число микроядер, останавливает митоз (Long et al., 1998).

Значения целостности цитоскелета для клеточной трансформации рассмотрено ранее и в работе Скотта (Scott, 1984). Автор считает, что изменения в строении цитоскелета, ведущие к нарушению связи ядра с плазматической мембраной, определяют некоторую функциональную автономию ядра, и в этом усматривает причину трансформации клетки. Недавно обобщённые данные о механизме действия лекарств, нацеленных на полимеризацию микротрубочек и актиновых нитей, на динамику этих процессов представлены в обзоре (Jordan, Wilson, 1998), где, в частности, обсуждён и вопрос: каким образом препараты, действуя на состояние микротрубочек, ингибируют пролиферацию клеток – блокируют митоз при переходе метафаза/анафаза и индуцируют апоптоз.

Деградация элементов цитоскелета и связанные с ней индукция синтеза ДНК и пролиферации могут быть следствием нескольких причин, в основе которых – постулируемое в опухолевой клетке избыточное ПОЛ и вызываемые им эффекты. По некоторым данным (Tash et al., 1981), сАМР стимулирует образование микротрубочек в различных типах клеток, содействуя фосфорилированию тубулина сАМР-зависимой протеинкиназой. Такое фосфорилирование необходимо как для полимеризации, так и для их функционирования. Логично, что в условиях дефицита сАМР формирование микротрубочек должно быть нарушенным. Это коррелирует с известными фактами деполимеризации тубулина некоторыми митогенами. С указанной точки зрения, предложение использовать для лечения рака сАМР и другие вещества, восстанавливающие цитоскелет (Scott, 1984), представляется обоснованным, правомерным.

Для поддержания структуры пучков актиновых микрофиламентов необходим постоянный приток энергии, а ограничение синтеза АТР вызывает обратимое разрушение этих пучков (Васильев, Гельфанд, 1981). Косвенно это давнее положение поддерживается и по следующим мотивам. Есть данные, что малые АТРазы – члены семейства белков Rho – участвуют в регуляции сборки актинового цитоскелета и мультибелковых комплексов, которые содержат интегрины и опосредуют межклеточную адгезию. Те же АТРазы значимы и в онкогенезе (Hotehin, Hall, 1996). Очевидно, при дефиците АТР функция упомя-нутых АТРаз окажется исполненной в недостаточном объёме, а энергозави-симые процессы сборки цитоскелета и межклеточных контактных структур – фактически не реализованными. Такая ситуация складывается, по-видимому, и при канцерогенезе вследствие снижения интенсивности митохондриального дыхания и дефицита АТР.

Не исключено, что к механизму разрушения цитоскелета в стимулированной к пролиферации клетке имеет отношение новое семейство протеинкиназ MARK. Как отмечают авторы исследования (Drewes et al., 1997), эти энзимы фосфорилируют соединённые с микротрубочками белки τ, MAP2 и MAP4, приводя к диссоциации комплекса и запуску распада микротрубочек. Два MARK-белка крысы, кодируемые разными генами, оказались Ser/Thr-киназами с мол. м. 81 и 88 кД. Такие белки широко распространены, а гомологичные им гены обнаружены и у человека. Каталитическая активность MARK-белков зависит, в свою очередь, от фосфорилирования двух аминокислотных остатков в одном из субдоменов. Данную функцию выполняет, по-видимому, какая-то «митогенная» протеинкиназа и, может быть, даже одна из изоформ PKC. В этой связи уместно вспомнить о другой работе (Jaken et al., 1989), в которой пока-зано, что активация изофермента PKC-3 сопровождалась деполимеризацией микрофиламентов, нарушением их связи с плазматической мембраной.

С дезорганизацией микрофиламентов и микротрубочек связывают сейчас ряд изменений в трансформированной клетке и, в частности, изменение клеточной поверхности: некоторые из её компонентов, например рецепторы и фиб-ронектин, исчезают или содержание их значительно уменьшается. Указанная причинная связь может быть обусловлена «заякориванием» в норме определённых мембранных и надмембранных компонентов изнутри, т. е. прикреплением их к кортикальным структурам под мембраной, наиболее характерной составляющей которых являются микрофиламенты. Нарушение процесса заякоривания мембранных рецепторов кортикальными микрофиламентами может играть первостепенную роль в изменениях нормы реакций у трансформированных клеток (Васильев, Гельфанд, 1981). К результатам подобных изменений относится и снижение способности этих клеток удерживать на поверхности фибронектин, другие соединения и структуры, что, по всей вероятности, уменьшает контактное торможение и зависимость размножения от подложки, а это не может быть безразличным для проявления таких свойств как инвазивный рост и метастазирование неоплазм (см. п. 2.4).

Существуют и другие примеры того, что структурные изменения цитоскелета, будучи следствием комплекса метаболических процессов в ростстимулированной и трансформированной клетках, в свою очередь, в порядке обратной связи снова сопрягаются с метаболическими, само же сопряжение, вероятнее всего, организуется на поверхностях мембран. Реальными, в частности, представляются сопряжение элементов цитоскелета с аденилатциклазой, зависимость её активности от состояния этой связи. Установлено (Воейков, 1984), что компоненты аденилатциклазной системы непосредственно или через неидентифицированных посредников действительно прикреплены к элементам цитоскелета, состояние которого небезразлично для функционирования этой системы. Единичные утверждения, что агенты, дестабилизирующие цитоскелет, активируют аденилатциклазу, противоречат многочисленным фактам о снижении уро-вня сАМР в пролиферирующих и трансформированных клетках и изложенной выше логике суждений по данному вопросу.

2.3.5. Рассмотрим теперь возможную связь канцерогенеза с нарушением цитоскелета, имея в виду организующую роль цитоскелета и представляя его как упорядоченную систему транспортных линий. Цитоплазматические структуры и внутриклеточные материалы в норме располагаются и передвигаются вдоль микротрубочек и актиновых филаментов. На этот счёт известны многие факты. Так, анализ распределения митохондрий в цитоплазме нескольких линий нормальных и трансформированных клеток при избирательном разрушении элементов цитоскелета показал чёткую корреляцию между распределением митохондрий и организацией микротрубочек и промежуточных филаментов. Подобной корреляции не было по отношению к микрофиламентам (Summerhayes et al., 1983). По другим данным (De Priester, 1984), в нормальных клетках митохондрии размещены вдоль пучков актиновых филаментов и микротру-бочек, и типичная подвижность митохондрий ограничена областью мембран эндоплазматического ретикулума.

Особенно чётко роль микротрубочек и актиновых филаментов в движении митохондрий показана в аксонах и дендритах культивированных нейронов гиппокампа, выделенных из плода крысы (Ligon, Steward, 2000). Нокодазол, разрушая сеть микротрубочек, останавливал движение митохондрий. Цитохалазин D, индуцирующий агрегацию актиновых филаментов, прекращал движение большей части митохондрий, а деполимеризующий филаменты актина латрункулин B не влиял на их подвижность. Считают, что актин принимает участие не только в двигательной реакции, но также и в координации обменных процессов клетки. В частности, F-актин комплексируется с гликолитическими ферментами, и активность некоторых из них в результате такого взаимодей-ствия меняется (Поглазов, 1996).

В клетках почки с ненарушенными микротрубочками элементы аппарата Гольджи располагаются компактно вблизи микротрубочкоорганизующего центра. При этом обнаружены два типа соединений этих элементов с микротрубочками: латеральный и более стабильный «конец в конец». При дестабилизации микротрубочек нокодазолом элементы аппарата Гольджи рассеиваются по цитоплазме (Rogalski, Singer, 1984).Взаимодействие эндоплазматического ретикулума с микротрубочками способствует образованию мембраносвязанных полирибосом и транспорту к последним мРНК, поскольку разрушение микротрубочек приводит к исчезновению мРНК из указанных рибосом (Walker, Whitfield, 1985). Касаясь ответственности микротрубочек за организованное расположение в цитоплазме митохондрий, элементов эндоплазматического ретикулума, аппарата Гольджи и лизосом и направленное внутриклеточное движение этих органелл, ряд авторов обзорных работ отмечает любопытные факты. Так, транспортную функцию микротрубочек обеспечивают «моторные» белки кинезин и динеин, представляющие собой механоферменты (АТРазы). Они связываются с мембраной органеллы, а их АТРазные «головки» взаимодействуют со стационарной микротрубочкой, что в присутствии АТР вызывает скольжение по ней органеллы как по рельсу (Васильев, 1996). Новейшие данные о механизмах движения клеточных органелл при участии микротрубочек и моторных белков освещены в ряде последующих обстоятельных обзоров (см., например, Hirokawa, 1998; Lane, Allan, 1998).

Наконец, несомненна значимость элементов цитоскелета в обеспечении взаимоотношений цитоплазмы и ядра (Hall, 1984), а по аналогии с цитоскеле-том роль помощника в сборке сложных комплексов и регулятора фермента-тивных процессов может играть и ядерный скелет (Поглазов, 1996). В связи с рассмотрением с позиций биоэнергетики теории теломерного старения и иммортализации соматических клеток, а также проблемы клеточной дифферен-цировки и пролиферации нами в п. 1.4.2 и 3.6.4 обсуждено положение о том, что цитоскелет и ядерный матрикс переходят в состояние дестабилизации по триггерному принципу. Тогда целостному цитоскелету должна соответствовать слабо выраженная скелетная структура ядра, а высокоразвитому ядерному матриксу – деструктурированный цитоскелет (Збарский, 1988). Небезынтерес-но, что к становлению указанной взаимосвязи состояний фибриллярной структуры ядра и актинового цитоскелета считают причастным продукт клеточного онкогена c-src (Chang L.-H. et al., 1995). Это обстоятельство открывает, на наш взгляд, дополнительные (к указанным в п. 2.3.9 и 2.3.10) возможности для понимания специфики ядерно-цитоплазматического отношения на разных эта-пах дифференцировки и пролиферации клетки.

К названному выше типу взаимодействия скелетной структуры ядра и цитоплазмы имеет, по-видимому, отношение состояние промежуточных фила-ментов как элементов цитоскелета. На это указывают, в частности, результаты действия ретиноевой кислоты на систему ядерный матрикс – промежуточные филаменты в клетках аденокарциномы желудка человека (Li Q.-F., 1999). Оказалось, что клетки этой линии под влиянием указанной кислоты претерпевали восстановительные изменения в системе ядерный матрикс – промежуточные филаменты, сходные с таковыми нормальных клеток. Эти изменения, как считает автор, «являются важным морфологическим и функциональным проявлением реверсии злокачественного фенотипа раковых клеток». Для последних, как отмечалось выше, вообще характерны дестабилизация структурных элементов цитоскелета, включая промежуточные филаменты, и соответственно целостность ядерного скелета на протяжении большей части клеточного цикла, что и способствует неконтролируемой пролиферации раковых клеток. Действие же ретиноевой кислоты по восстановлению взаимосвязи между ядерным матриксом и прежде нарушенным цитоскелетом (промежуточными филаментами) направлено на исправление указанного дефекта. В таком поведении ретиноевой кислоты есть что-то связанное с известной её ролью фактора дифференциро-вки клеток. Однако, несмотря на большую литературу, механизм, обеспечива-ющий указанные эффекты ретиноевой кислоты, остаётся пока малопонятным.

По обсуждаемому вопросу кажутся интересными и следующие наши представления, отчасти уже затронутые в некоторых параграфах главы 1. Речь идёт о нормальной организации поточной работы в клетке, когда необходимость фиксированного расположения цитоплазматических структур и транспортных коммуникаций к ним очевидна; иначе, т.е. в случае произвольной локализации в пространстве и пребывания в состоянии броуновского движения, системность и согласованность их действий будет затруднена, неизбежными станут всевозможные диспропорции в протекании множества процессов во времени и пространстве. Более того, некоторые из специфических функций могут оказаться в этих условиях практически нереализуемыми. Здесь вполне уместна аналогия с любым чётко налаженным производством – промышленным или сельскохозяйственным. Каждое такое производство имеет свои конкретные адрес, каналы передачи информации, транспортные пути для получения и (или) сбыта сырья, полуфабрикатов и готовой продукции. Легко представить себе трудности, с которыми столкнулись бы производство, не имеющее постоянного места прописки, и поставщики для него, вынужденные каждый раз искать новое местопребывание заказчика и соответствующие транспортные линии и средства для обеспечения его материалами. Наиболее вероятный исход в такой ситуации – дезорганизация производственного процесса, срыв количественно-качествен-ных показателей плана.

То же самое происходит, по-видимому, в цитоплазме опухолевой клетки, где структурные элементы цитоскелета, как отмечалось выше, особенно густая сеть микротрубочек, в той или иной степени деградированы, нарушаются направленное перемещение внутриклеточного материала вдоль микротрубочек и взаимодействие между ними и клеточными органеллами в пространстве. Это не может не отразиться на характере и качестве функционирования прежде ассоциированных с микротрубочками микросом, митохондрий, пероксисом, аппарата Гольджи, на ядерно-цитоплазматических взаимоотношениях. Расстройство упорядоченных внутриклеточной локализации и движения органелл, а также транспорта веществ может служить немаловажным дополнительным фактором, способствующим сужению набора специальных функций, включая специальные белковые синтезы, и тем самым развитию канцерогенеза.

Особенно интересным представляется возможное образование «сопутствующего» пути поддержания в клетках неоплазмы гипероксии, повышенных уровней АФК и неферментативного ПОЛ при нарушении транспортных коммуникаций. Он связан с дезорганизацией микротрубочек и соответственно упо-рядоченного до этого расположения на них, в частности, митохондрий и пероксисом. В этом случае эффективная адресная доставка О₂, поступившего в клетке, к митохондриям и пероксисомам будет затруднена, а само потребление ими О₂ – искусственно лимитированным. Данная вполне логичная гипотеза (о ней см. также п. 1.7.1.4, 1.7.3.2, 2.1.13, 4.2.4 и 7.1.8) косвенно подтверждается, на наш взгляд, следующим фактом. Воздействие на стареющие нейтрофильные гранулоциты фаллоидином, стабилизирующим F-актин, подавляло генерацию О , а разрушение F-актина цитохалазином В, наоборот, усиливало эту генерацию. Такие же соответственно эффекты вызывали таксол, стабилизирующий микротрубочки, и разрушающий их колхицин (Piazzolla et al., 1998).

Таким образом, при расстройстве транспортных линий в цитоплазме опухолевые клетки должны испытывать дополнительные затруднения в утили-зации внутриклеточного О₂. Напротив, стабилизация микротрубочек может снизить «канцерогенезный» уровень дисбаланса ∆_К (ПО – АО) до апоптозного ∆_А1 (см. п. 7.1.8) и даже ниже, умерить бесконтрольное размножение опухолевых клеток. Об этом свидетельствуют приведённые выше данные о противоопухолевом действии таксола. Дополнительно приведём ещё несколько фактов. На линиях клеток лимфомы Jurkat, лимфом BJAB и Raji с помощью микро-скопии, проточной цитометрии и гель-электрофореза ДНК показано, что таксол ингибирует рост и индуцирует апоптоз клеток всех трёх линий (Zhou et al., 1999). Он же дозо- и времязависимо подавлял рост клеток SMMC-7721 гепатомы человека in vitro. В частности, после обработки этих клеток таксолом в дозе 10 нмоль/л наблюдали заметное накопление их в фазе G₂/M; в этой же дозе таксол индуцировал апоптоз клеток гепатомы (Yuan et al., 2000).

С рассматриваемых позиций логичной представляется и следующая важная информация, полученная при изучении биогенеза микротрубочек в клетках остеосаркомы человека линии 143В и клетках из печени крысы RL-34. Деполимеризация микротрубочек нокодазолом или колхицином ингибировала увеличение массы митохондрий и репликацию мтДНК. Обработка же клеток таксолом приводила к увеличению массы митохондрий, при этом были выявлены две категории митохондрий – с высоким и низким мембранным потенциалом. Указанное увеличение снималось при совместной обработке клеток таксолом и нокодазолом или таксолом и колхицином (Karbowski et al., 2001). Мы полагаем, что при дестабилизации микротрубочек естественным должны быть нарушение адресного транспорта к митохондриям материалов, необходимых для их синтеза и функционирования, и соответственно ослабление митохондриальной базы. Напротив, целостные цитоскелет и, в частности, система микротрубочек создают нормальные в указанном смысле условия для биогенеза митохондрий. При этом упомянутые выше две категории митохондрий идентифицируются, по-видимому, как расположенные соответственно в периферийной зоне клеток, функционально полноценные с высоким мембранным потенциалом и околоядерные относительно примитивные, слабодифференцированные с низким мем-бранным потенциалом (см. п. 3.6.1). Вообще же, данных о непосредственной причинной связи дезорганизации транспортных путей с канцерогенезом пока нет, и в этом плане наше представление о кислородно-перекисном механизме реализации указанной связи, вкратце изложенное недавно (Лю, Исмаилов, 2000), является, по-видимому, первым.

2.3.6. Пероксигеназные условия в опухолевых клетках (Лю, Ефимов, 1976; Лю, Саприн, 1980) и токсическое действие продуктов ПОЛ на тиоловые группы белков (Владимиров, Арчаков, 1972) согласуются с концепцией о повреждении в этих клетках тиолового механизма сборки митотического аппарата (Алов, 1972) как одной из причин патологических митозов при канцерогенезе. Веро-ятно, липидные радикалы и перекиси наряду с деструктивным эффектом протеиназ непосредственно воздействуют на указанный механизм, нарушают ци-тоскелет, сборку белков митотического аппарата в ориентированную систему веретена деления, а также деление центриолей и расхождение хромосом.

Повреждение тиолового механизма не исключает одновременных нарушений в неоплазме синтеза белков митотического аппарата и цитоскелета вследствие расстройства регуляции, вероятно, в подсистеме управления клеточным циклом. Здесь уместно сослаться на исследования, предпринятые с целью выявления различий в содержании белков цитоскелета у нормальных и трансформированных клеток. Обнаружено, в частности, снижение синтеза тропомиозина при трансформации фибробластов куриного эмбриона вирусом саркомы Рауса и фибробластов перепела ретровирусом МС-29 или метилхолантреном. Этот эффект специфичен именно для трансформации, поскольку отсутствовал при инфицировании вирусом саркомы Рауса без src-гена и его ts-мутантом при непермиссивной температуре и не был результатом разрушения системы микрофиламентов. Как полагают авторы данного эксперимента (Hendricks, Weintraub, 1981), понижение синтеза тропомиозина связано с подавлением транскрипции соответствующего гена и отражает лишь часть изменений программы транскрипции в клетках неоплазмы.

Таким образом, для малигнизированной клетки характерно возникновение противоречивой ситуации: низкий уровень сАМР, постоянная функция подсистемы управления клеточным циклом и ряд других изменений, рассматриваемых в п. 2.3, создают условия, с одной стороны, для синтеза и репликации ДНК, разъединения сестринских хроматид и непрерывного вхождения в митотический цикл, а с другой – для нарушений при липидной пероксидации тиолового механизма формирования митотического аппарата, сборки и функционирования элементов цитоскелета. Сочетание этих двух моментов не может не привести к гетеро- и полиплоидии, так часто сопутствующих малигнизации. Кроме давно известных материалов на этот счёт (Алов, 1972; Казанцева, 1982), можно отметить и относительно новые.

По данным мультивариантного анализа 84 препаратов гепатоцеллюлярного рака в 68 установлена анеуплоидия и в 7 – полиплоидия. Показана достоверная связь между анеуплоидией и множественностью опухолей, что позволяет использовать плоидность ДНК в качестве прогностического параметра при раке печени (Zeppa et al., 1998). Изучение плоидности и пролиферативной активности 80 астроцитомов человека показало существование большого числа клеточных популяций, даже в случае умеренной злокачественности опухолей. В 64 % наблюдалась одна однородная популяция с индексом ДНК в пределах дипло-идного. Остальные имели анеуплоидию с присутствием других гетерогенных популяций. Число последних и количество клеток в S-фазе увеличивалось с повышением степени злокачественности неоплазм, причём для разных их зон отмечена значительная вариабельность этих показателей (Leel-Össy et al., 1997). Аналогичные, по сути, сведения об изменении плоидности ДНК в астроцитомах представлены и в других работах (см., например, Krutman-Zveibil et al., 1999).

Изучение пролиферативной активности и плоидности ДНК клеток рака молочной железы у 45 больных в возрасте 32-80 лет показало следующее. У 31 пациентки опухолевые клетки имели высокий пролиферативный индекс; анеуплоидные клетки выявлены у 32 больных, у 13 – они были диплоидными (Pisani et al., 1999). Определение с помощью проточной цитометрии содержания ДНК в 45 образцах рака желудка человека показало, что наибольший процент анеу-плоидных клеток (33,3 %) приходился на рак, а при хроническом гастрите, кишечной метаплазии и в нормальной слизистой желудка этот процент был ну-левым (Xing et al., 2000).Особенно высокий уровень полиплоидности выявлен в карциномах коры надпочечников у человека. В этой группе опухолей не было случаев диплоидности, зато 90 % их были три- и тетраплоидными. Последние отсутствовали в группе доброкачественных аденом (Pignatelli et al., 1998).

Одним из проявлений обсуждаемого механизма может быть ослабление центромерной связи между сестринскими хроматидами в опухолевых клетках, способствующие эндоредупликации хромосом и лёгкому возникновению полиплоидных клеток в опухолях. С тех же позиций можно понять и другой известный факт: повышенную чувствительность малигнизированных клеток к дей-ствию веществ, нарушающих веретено деления. По-видимому, в условиях пероксидации разрушающее действие подобных веществ дополняет и усили-вает уже начатый продуктами ПОЛ или обусловленный дефицитом сАМР аналогичный процесс, и в этом смысле их «деструктивная» задача несколько облегчается, а такие клетки неоплазмы действительно окажутся более чувст-вительными к повреждению митотического аппарата.

Интересна анеуплоидная гипотеза рака, по которой анеуплоидия играет более кардинальную роль в канцерогенезе, а не является просто одним из специфических признаков раковых клеток. Авторы её (Rasnick, Duesburg, 1999), опираясь на известное положение о том, что нормальный фенотип клеток кон-тролируется в различной степени всеми генетическими компонентами сложных систем, пришли к выводу о действии этого принципа и в клетках неоплазмы. Для онкотрансформации клеток необходимо изменение функций большого числа генов, что характерно для анеуплоидии. Последняя фактически влияет на метаболический контроль и определяет «раковый» фенотип, т. е. все признаки его являются следствием анеуплоидии. Эти сдвиги в принципе тоже могут быть представлены как результат развития канцерогенеза по кислородно-пере-кисному механизму.

2.3.7 Перекисное окисление фосфолипидов в той или иной степени ответственно за повреждение мембран эндоплазматического ретикулума в клетках неоплазмы. Наряду с дезынтеграцией микросомальных мембран происходят существенные изменения состояния монооксигеназной ферментной системы и, в первую очередь, главного её компонента – цитохрома Р-450 (CYP), под наз-ванием которого числится фактически целая группа его изоферментов. Как известно, эти ферменты участвуют в большом наборе реакций с множеством субстратов: нормальных клеточных компонентов, модификация которых составляет нормальный процесс их метаболизма, и чужеродных соединений, превращающихся в ряде случаев в продукты с патологическими свойствами, в том числе канцерогенными. Условные изображения 2 типов оксигеназных реакций с включением одного или обоих атомов О₂ в субстрат (Бохински, 1987) показаны ниже:

SH₂ + DH₂ + O₂ → HS-OH + H₂O + D;

SH₂ + O₂ → HO-S-OH,

где SH₂ – донор электронов, а DH₂ – органическое соединение в роли донора водорода.

Основные исследования по состоянию монооксигеназной ферментной сис-темы в опухолях проводились на перевиваемых гепатомах. Результаты свидетельствуют в пользу того, что в опухолях содержание CYP и b₅ и их функци-ональная активность снижены по сравнению с гомологичной нормальной тканью. В них, как правило, нарушено и характерное для нормы соотношение изоформ CYP (Кобляков, Коляда, 1986). Так, в клетках медленнорастущей гепатомы Морриса 9618А уровень фермента CYP снижен на 80 %, а в клетках быстрорастущей гепатомы 3924А он фактически отсутствует (Massoti et al., 1989). Состояние монооксигеназной ферментной системы в опухолях человека освещено лишь в единичных работах. Например, было показано, что у 5-ти исследованных гепатобольных содержание CYP в опухолях было снижено примерно в 10 раз по сравнению с его уровнем в окружающей ткани (Sasaki et al., 1984). Из 16-ти находившихся под наблюдением онкобольных у 12-ти мета-болическая активность CYP2С19 была ниже, чем у здоровых испытуемых (Wiliams et al., 2000).

При активации NADPH-специфичного и аскорбатзависимого ПОЛ окис-ляются прежде всего ненасыщенные жирные кислоты из фосфолипидного окружения CYP, где расположены радикалинициирующие центры. При этом фермент CYP, очевидно, инактивируется, но после восстановления состояния указанного его окружения он в принципе готов к повторному «включению». Зависимость активности CYP от фосфолипидов показана, в частности, на при-мере CYP1А2. Наиболее эффективными активаторами его были фосфатидил-холины с числом атомов углерода в углеводородной цепи 8-12 (Yun et al., 1997). В свою очередь, содержание CYP и липидов является лимитирующим фактором в активности переокисления липидов. Токсические продукты, образующиеся при NADPH-зависимом перекисном окислении микросомальных липидов, достаточно стабильны и способны диффундировать, т.е. могут вызывать ток-сический эффект на некотором расстоянии от места протекания липидной пероксигенации (Benedetti et al., 1979).

Названные выше эффекты в основном известны давно, но сведения о них периодически уточняются и/или пополняются новыми фактами. Например, в недавнем обстоятельном обзоре (Арчаков и др., 1998) рассмотрены механизмы реакций окислительной самоинактивации и модификации CYP и некоторых других макромолекул. Подчёркнута важная особенность CYP: он не только генерирует Н₂О₂ и иные АФК, но и сам инактивируется под их действи-ем. Детальнее исследован механизм окислительной модификации CYP2В4 в монооксигеназной реконструированной системе, включающей также NADPH-специфичный флавопротеин и цитохром b₅. Показано, что окислительное изменение CYP сопровождается деструкцией гема и модификацией апофермента. Кроме того, АФК участвуют в окислении SH-групп белка-фермента и в образовании карбонильных групп на его молекуле. Как полагают авторы, самоинактивация и модификация CYP и других ферментов под действием АФК в процессе катализа могут лежать в основе механизма удаления их эндогенными проте-азами. Вообще же, это связано с тем, что у окисленных белков нарушается пространственная структура, они утрачивают активность и становятся высокочувствительными к протеолизу (Dean et al., 1997).

В условиях гипероксии и повышенной пероксигенации, характерных для опухолевых клеток, указанные выше изменения в микросомах должны быть, очевидно, более выраженными. К тому же, окислительный стресс оказывает негативное влияние на регуляцию транскрипции некоторых генов CYP. В частности, обработка клеток HepG2 человека или гепатомы Н4 крысы пероксидом водорода подавляет связывание ядерного фактора NF1 с его сайтом в ДНК, локализованном в проксимальном промоторе гена CYP1А1. Предположительно, NF1 обладает повышенной чувствительностью к окислительному стрессу, что и приводит к ингибированию активности промотора и соответственно подавлению экспрессии CYP1А1 (Morel, Barouki, 1998). Определённый вклад в инактивацию ферментов микросом может вносить и синтезируемый в клетках неоплазмы NO. Показано, в частности, что in vivo NO ингибирует CYP, и этот процесс, по мнению Хаценко (1998), реализуется по двум механизмам: прямое влияние на активность фермента путём связывания с его гемом и угнетение экспрессии гена CYP.

С другой стороны, обращено внимание на риск развития ракового заболевания при сверхэкспрессии CYP, поскольку существует корреляция между индукцией его изоферментов и уровнем О₂ – одним из ведущих факторов канцерогенеза (Paolini et al., 1996; см. также п. 2.3). И действительно, к настоящему времени накоплен весомый экспериментальный материал об индукторах суперсемейства CYP как, прежде всего, промоторов канцерогенеза. Многие вопросы, касающиеся механизма действия этих индукторов, подробно рассмотрены в работе Коблякова (1998). Из числа цитированных и обобщённых им литературных материалов и высказанных идей наиболее интересными, с точки зрения кислородно-перекисной модели канцерогенеза, представляются нам все эффекты индукторов CYP, опосредованные действием образующихся при функционировании данного фермента АФК.

Как принципиально важные, выделим: митогенное действие АФК (Burdon, 1992, 1995; Burdon et al., 1996; Bhunia et al., 1997 и др.) и активацию ими некоторых факторов транскрипции (Flohe et al., 1997; Renard et al., 1997; Mazi-ere et al., 1999; Турпаев, 2002 и др.); нарушение межклеточных коммуникаций кислородным стрессом (Hu Y. et al., 1995; Lo et al., 1998; Wenk et al., 1999), вызываемое, предположительно, активацией АФК онкобелка c-src (Lee et al., 1996; Griendling et al., 2000), фосфорилированием последним белков межклеточных контактов, в частности коннексина-43, и выходом их из мембраны клетки (Yamasaki, Naus, 1996 и др.); участие АФК в высвобождении из ферритина ионов Fe, катализирующих образование различных АФК (Puntarulo, Cederbaum, 1996); активацию АФК выхода из мембраны свободной арахидоновой кислоты (Martinez, Moreno, 1996) и последующий её метаболизм на CYP с образованием высокореактивных О₂-содержащих метаболитов и новых АФК.

Опираясь на указанные выше работы и мнение о белке c-src как первичном объекте воздействия АФК (Devary et al., 1992; Lee et al., 1996), Кобляков (1998) высказал также свою точку зрения, отметив, что «митогенный эффект и блокирование межклеточных коммуникаций при действии АФК реализуются через общее звено посредством активации продукта гена c-src», причём «не исклю-чено существование некоего неизвестного рецептора АФК, который приводит в действие продукт гена c-src, запуская каскад киназных реакций». Поскольку конкретные механизмы активации обсуждаемых АФК-зависимых эффектов индукторов CYP пока неизвестны, то естественно ожидать получения здесь каких-то важных «связующих» фактов. Можно, например, проверить, причастны ли внутриклеточные АФК и продукты ПОЛ, образующиеся в избытке под влиянием промоторов, к хотя бы некоторым эффектам последних за счёт известной способности их активировать PLA₂. Активация белка c-src проокси-дантами также может происходить косвенно, а пока, судя по публикациям последних лет, известно, что модуляция активности продукта гена c-src осуществляется в основном протеинкиназами, в частности, некоторыми рецептор-ными тирозинкиназами (см. п. 3.4.2).

Обсуждая роль CYP как промотора канцерогенеза, важно знать также, ка-кие из образующихся в клетке продуктов способствуют развитию при участии CYP ракового заболевания. В этом отношении заслуживают внимания следую-щие научные материалы. В микросомах печени человека был обнаружен фермент, превращающий простагландин-эндопероксид в гидроксигептадекатриеновую кислоту и MDA. Этот процесс не зависел от CYP-редуктазы, но связан с CYP. Активности очищенных CYP к указанному субстрату (50 мкМ) варьировали, и по этому показателю некоторые его изоформы располагались в последовательности: 3А4 >> 2Е1 > 1А2. Авторы данной работы (Plastaras et al., 2000) допускают, что при коэкспрессии COX-2 и изоформ CYP в процессе канцеро-генеза может возникать нестабильность генома, обусловленная образованием MDA – эндогенного мутагена. Возникновение такой канцерогенной ситуации в дополнение к создаваемой недостаточностью митохондриального дыхания вполне реально, если учесть избыточные синтез и активность COX-2 при канцерогенезе (см. п. 2.1.11).

Процесс деградации микросомальных мембран естественно связать с высвобождением интегрированных с ними рибосом. Это объяснило бы известный феномен: в цитоплазме опухолевых клеток резко уменьшена доля гранулированного эндоплазматического ретикулума и увеличено количество свободных полирибосом (Бердинских, 1983), которые являются системой синтеза белков, необходимых для удовлетворения внутренних потребностей клетки. Не исключено, что к этому разобщению причастно рассмотренное выше снижение уровня CYP, поскольку есть, правда, давние сведения о возможном участии этого фермента во взаимодействии рибосом с эндоплазматической мембраной (Ohls-son, Jergil, 1977). Причиной преобладания свободных полирибосом в опухолевой клетке могут быть также уже рассмотренные в п. 2.3.4 деструктивные изменения элементов цитоскелета, в том числе микротрубочек. Эксперименты по изучению влияния колхицина, разрушающего эти структуры, на связь с мембраной полисом печени крыс показали: цитоплазматические микротрубочки необходимы для образования связанных с мембранами полирибосом. Действительно, после введения колхицина из фракции таких полирибосом исчезали мРНК, но не рРНК. Колхицин не влиял на содержание мРНК и рРНК во фракции свободных полисом (Walker, Whitfield, 1985).

Значительное преобладание в опухолевых клетках свободных полирибосом за счёт соответствующего уменьшения мембраносвязанных детерминирует ряд изменений, вносящих вклад в характерные черты «ракового» обмена. Так, усиленный в гепатоме синтез ключевого фермента гликолиза гексокиназы происходит в основном на свободных полирибосомах (Нейфах и др., 1977). Это явление, связываемое авторами со сдвигами в энергетическом обмене малигнизированных клеток, несомненно, способствует усилению гликолиза. Синтез in vitro Cu-, Zn- и Mn-SOD печени крыс также осуществляется преимущественно в присутствии фракции свободных полирибосом (Hirano et al., 1985). Если это признать типичным явлением, то в опухолевых клетках содержание SOD должно быть увеличенным.

С другой стороны, несмотря на некоторую противоречивость мнений, достоверно установлено, что активность этих ферментов в ряде типов неоплазм существенно ниже, чем в нормальных тканях (Marinaccio et al., 1990). Такое несоответствие между потенциально возможным повышением уровней SODs и низкой их активностью в опухолях может объясняться, в частности, данными об ингибировании указанных ферментов первичными продуктами ПОЛ мемб-ран (Гудзь и др., 1982), избыточное содержание которых постулируется нами в активно растущих участках опухоли. По-видимому, системы образования и детоксикации О находятся в каком-то регуляторном взаимодействии: в норме активность SODs определяется уровнем О ; при усилении же ПОЛ, сопровож-дающем пролиферацию клеток, разобщаются рибосомомембранные связи, т. е. создаются условия для появления свободных полирибосом и активизации синтеза на них SOD, призванных защитить клеточную среду от токсического действия О и его производных. Однако при канцерогенезе избыточное ПОЛ выходит за нормальные допустимые пределы изменения, и в этих условиях инактивации продуктами ПОЛ подвергаются и сами SODs.

Другая часть негативных эффектов при дестабилизации микросомальных мембран вызвана дефицитом мембраносвязанных полирибосом. Наряду со снижением количества синтезируемых на них глутамат- и малатдегидрогеназы, цитохрома с и белков внешней мембраны митохондрий (Бердинских, 1983), о чём уже упоминалось в п. 2.1.7, в опухолевой клетке ещё более усугубляется ситуация с уменьшением содержания цитохромов CYP и b₅, поскольку они синтезируются только на прочно связанных с мембранами полирибосомах (Apffel, 1982). Падает и синтез на них специфических для дифференцированных клеток белков. В качестве приспособительной меры синтез в опухолях некоторой части белков, предназначенных для секреции, «организуется» на свобод-ных полирибосомах. Однако такие белки почему-то оказываются «лишними» и подвергаются деградации (см. Берман, 1985).

Микросомальная гипотеза канцерогенеза (Apffel, 1982), постулируя необратимую дегрануляцию шероховатого эндоплазматического ретикулума канцерогенами и нарушение контроля над синтезом белка, связывает эти изменения с нарушением мембран микросом. Однако она не даёт ответа на главные вопросы: каким образом канцерогенные агенты, в частности химические, повреждают эти мембраны, каков конкретный механизм взаимодействия их с микросомами. С точки же зрения кислородно-перекисной модели, указанные изменения в мембранах микросом не первичны, не связаны прямо с канцерогенным воздействием, а есть лишь одно из следствий создающейся внутриклеточной гипер-оксии и последующей пероксидации липидов во всех мембранах.

Известная естественная функция микросом подвергать метаболическому превращению ксенобиотики может быть квалифицирована как соучастие микросом в кислородно-перекисном механизме канцерогенеза. Наиболее реально это в тех случаях, когда в ходе указанного превращения образуются АФК. К числу таких примеров можно отнести микросомную активацию тамоксифена и 4-гидрокситамоксифена в присутствии NADPH, сопровождающуюся генера-цией АФК. Последние приводят к образованию 8-OH-dG, с чем и связывается канцерогенное действие тамоксифена (Ye, Bodell, 1996). Действие гетероциклических аминов, одной из наиболее хорошо изученных групп канцерогенов, сопровождается образованием О в присутствии CYP или CYP-редуктазы и нередко окислительной модификацией яДНК (Sato et al., 1992; Маеда, Акаике, 1998). Если же при метаболическом превращении канцерогенов непрямого действия возникают конечные канцерогены, как, например, в реакции 2′-гидро-ксилирования никотина CYP2A6 и микросомами человека (Hecht et al., 2000), то объектом прямой атаки их, как отмечалось в п. 2.1.1, могут быть прежде всего митохондрии, а внутри них – дыхательные ферменты и мтДНК.

Считаем уместным указать здесь и на следующее возможное «биокибернетическое» обобщение. Как нам представляется, переходу нормальной клетки в состояние пролиферации способствуют обратимые премитотические гипероксия и усиление ПОЛ в мембранах эндоплазматического ретикулума, что приводит не просто к «разборке» этих мембран, но и к высвобождению связанных с ними рибосом. Феномен дестабилизации мембрано-полирибосомных комп-лексов может иметь общее принципиально важное регуляторное значение, связанное с реализацией триггерного принципа взаимосвязи размножения и дифференцировки клетки. Было постулировано, что триггерный принцип регуляции здесь организован по двухкаскадной схеме: на нижнем уровне так взаимодействуют отдельные транскриптоны генома, а на верхнем – целые подсистемы в составе глобальной транскриптоно-триггерной сети (Лю, Ефимов, 1978). Разобщение связи полирибосом с мембранами микросом в интенсивно размножающихся клетках рассматривается как механизм поддержания их пролиферации и одновременно ограничения в них возможностей для специализации. Реализация этого механизма, видимо, осуществляется просто путём регуляции соотношения свободных и связанных полирибосом в зависимости от интенсивности стимулирующих пролиферацию сигналов. Это соотношение, будучи показателем материальной базы на этапе трансляции и отражением фактического состояния во взаимодействии подсистемы управления клеточным циклом с подсистемами дифференцировки (специализации), может указывать на целесообразное в данный момент распределение рибосом для специального белкового синтеза и на нужды размножения и роста клетки.

2.3.8. Гипероксия внутри опухолевой клетки создаёт благоприятные условия для работы пероксисомальной окислительной системы – одной из форм дыхания, поскольку уровень этого дыхания в отличие от митохондриального пропорционален напряжению О₂ в клетке (Панченко и др., 1981). Пероксисомальные оксидазы в норме обладают низким сродством к О₂ и утилизируемым ими субстратам, которые обычно не окисляются митохондриями. Для этих фер-ментов невысоки также избирательность действия и скорость катализируемых реакций. Однако при гипероксии эти ограничения становятся, по-видимому, менее жёсткими, и интенсивность пероксисомального окисления возрастает. Именно такие условия необходимы для реализации выдвинутого Панченко с соавт. (1981) положения о перекисной «агрессивности» пероксисом, способных играть существенную роль в клеточной патологии.

Участие пероксисом в перекисном обмене, их перекисная агрессивность применительно к процессу трансформации клеток – составная часть кисло-родно-перекисного механизма канцерогенеза. С этих позиций интересны следующие давние факты. Немутагенные химические канцерогены из группы пролифераторов пероксисом наряду с другими изменениями увеличивают интенсивность пероксисомального β-окисления жирных кислот, приводят к перекисному повреждению ДНК и инициации опухолевого роста, генерируя внутриклеточное образование Н₂О₂, индуцируют (до 100 %) гепатоцеллюлярные карциномы у крыс и мышей (Reddy et al., 1983). Сведения об индуци-ровании гиполипидемическими веществами пролиферации пероксисом печени грызунов и гепатоканцерогенеза опубликовывались этими авторами и в последующие годы, причём в одной из их работ показано, что антиоксиданты этоксихин и 2(3)-терт-бутил-4-оксианизол проявляли заметное антиканцерогенезное действие, и это объясняют способностью указанных антиоксидантов связывать Н₂О₂ и свободные радикалы. В обзоре (Rao, Reddy, 1987) высказано предпо-ложение, что пролифераторы пероксисом, не являясь мутагенами, действуют опосредованно путём взаимодействия с рецепторами мембран. В итоге активируются гены, кодирующие ферменты β-окисления в пероксисомах, генерируются Н₂О₂ и различные радикалы О₂, которые повреждают ДНК и инициируют канцерогенез.

В аспекте сказанного небезынтересны результаты сравнения активности пероксисомального β-окисления жирных кислот в различных тканях крыс, содержавшихся на нормальной диете (группа 1) или в течение 2 нед. на диете с 0,025 % пероксисомального пролифератора ципрофибрата (группа 2). Показано, что уровень мРНК каталазы в группе 2 возрастал в 2 раза в печени, почках, тон-кой кишке и сердце по сравнению с группой 1. Уровни транскриптов трёх генов системы β-окисления жирных кислот в печени крыс 2-й группы были увеличены более 20 раз, а в почках, тонкой кишке и сердце – в 2-4 раза. Эти факты говорят о том, что ципрофибрат повышает активность пероксисомального окис-ления в различных тканях, но в основном это гепатотропный агент. Как полагают авторы данного исследования (Nemali et al., 1988), непрерывная длительная индукция пролифераторами пероксисом системы пероксисомального окисления, вызывающая окислительный стресс, является основой канцерогенеза.

Пероксисомальные пролифераторы объявляются, по существу, новым классом негенотоксических канцерогенных агентов, индуцирующих окислительный стресс и, главным образом, гепатоканцерогенез путём подавления актив-ности GPX, повышения уровня Н₂О₂ и радикалов НО˙, усиления ПОЛ и окис-лительного повреждения ДНК (Reddy, Rao, 1989; Yelgani et al., 2000). Кроме того, в указанных условиях в печени аккумулируется первичный продукт ПОЛ липофусцин, известный как возрастной пигмент, маркёр старения клеток и тканей (см. п. 1.2.2). Этот факт не является проявлением случайности, а отра-жает общность первичных звеньев кислородно-перекисного механизма старения и канцерогенеза.

Сходная точка зрения высказана и в других работах. Так, индуцированную пролифераторами пероксисом повышенную и продолжительную пролиферацию клеток и окислительный стресс в результате метаболизма пероксисомного О₂ считают «критическим событием» канцерогенеза (Rose et al., 1999). Кроме того, экспрессия генов при введении в клетку пролифераторов пероксисом может быть следствием АФК-зависимой индукции ими определённых факторов транс-крипции, в частности фактора NF-kB (Li Y. X. et al.,2000), который действительно активируется АФК (Меньшикова, Зенков, 1997; Пескин, 1997; Renard et al., 1997; Rahmaan et al., 1998; Bonizzi et al., 2000; Турпаев, 2002) и ингибируется различными антиоксидантами (Ferrari et al., 1997; Kelly et al., 1997; Турпаев, 2002). Реальным представляется и другое: в норме указанные пролифераторы способствуют поддержанию окислительного митогенеза, однако, при избыточности ПО-составляющей дисбаланса ∆ (ПО – АО) в клетках печени грызунов индуцируется «пероксисомальный» канцерогенез.

Пока же большинством исследователей признаётся лишь то, что 1) механизм канцерогенности, индуцируемой пролифераторами пероксисом, является нетипичным по сравнению с другими канцерогенами печени; 2) пролифераторы пероксисом скорее участвуют в изменениях экспрессии соответствующих генов-мишеней, чем в непосредственном мутагенезе (Anderson S. P. et al., 1999). Кстати, в качестве негенотоксических (эпигенетических) канцерогенов рассма-риваются также пестициды, индуцирующие пролиферацию клеток, вызывающие рак печени и другие негативные изменения. Все эти эффекты не являются результатом прямых взаимодействий пестицидов с ДНК. Как полагают (Rakitsky et al., 2000), они «действуют как промоторы, индукторы реакционно-активных кислородных радикалов, пролифераторы пероксисом и индукторы цитохром Р-450-зависимых ферментов».

В «пероксисомальном» вопросе неясными остаются механизмы пролиферации пероксисом, индуцируемой различными по химической структуре лекарствами и канцерогенами. Эти аспекты обсуждались в ряде работ. Пероксисомы, как и митохондрии и некоторые другие внутриклеточные органеллы, связаны с микротрубочками, исполняющими роль транспортных путей, причём этому способствуют ATP, моторные белки кинезин и динеин (Thiemann et al., 2000). Данная информация наводит на мысль, которую мы неоднократно высказывали в отношении митохондрий (см., например, п. 2.1.13 и 2.3.5). Ассоциированные с микротрубочками пероксисомы, имея конкретное место своей «прописки», более доступны для адресной доставки к ним субстратов окисления, молекул О₂ и других веществ для своего нормального функционирования и позиционно обустроенного размножения. В опухолевых же клетках, характеризующихся дестабилизацией элементов цитоскелета и соответственно разупорядоченной локализацией на них пероксисом, роль последних в непосредственном установлении и поддержании окислительного стресса должна быть уже незначимой. К указанному стрессу они, как и митохондрии, причастны в основном косвенно, повышая внутриклеточное рО₂ вследствие слабого потребления О₂ при дестабилизированном цитоскелете. В общем же, не вызывают сомнений чёткая корреляция окислительного стресса с пролиферацией пероксисом и последующее формирование опухоли в печени при участии кислородных и перекисных радикалов (Gray et al., 1989; Yeldani et al., 2000). Большую роль увеличенного коли-чества пероксисом в окислительном стрессе и канцерогенезе отмечают и другие авторы (Oberley, Oberley, 1988; Rokos, Ledwith, 1997).

Участие пролифераторов пероксисом в гепатоканцерогенезе можно обсуж-дать и с позиций индукции ими некоторых изоформ CYP, при функционирова-нии которых образуются АФК, рассматриваемые как промоторы канцерогенеза (см. Кобляков, 1998). Указанные пролифераторы пероксисом индуцируют, в частности, CYP4А1 и CYP4А3 (Кржечковская и др., 2002). Действительно, в микросомах из печени животных, обработанных пролифераторами пероксисом, под влиянием образующихся АФК усиливается ПОЛ (Swierczynski et al., 1996). Однако, чтобы возникающая таким путём локальная «микросомальная» пероксигенация инициировала канцерогенез, она, по нашему мнению, должна перерасти в глобальный окислительный стресс, затронув прежде всего митохондрии. В этой связи понятен тот факт, что увеличение концентрации 8-OH-dG в ДНК (признака её окислительной модификации) печени крыс, подвергну-тых воздействию пролифераторов пероксисом, взаимосвязано с изменениями митохондрий (Sausen et al., 1995).

Итак, активация пероксисомального окисления и зарождающийся окисли-тельный стресс отражаются, несомненно, на многих внутриклеточных процес-сах, но по изложенным выше причинам (см. п. 2..1) особенно чувствительны к ним митохондриальные. Последние в указанных условиях становятся функционально неполноценными и в этом качестве способствуют устойчивому поддержанию в клетке гипероксии и повышенного уровня ПОЛ. Поэтому искусственно активируемое пероксисомальное окисление приводит к состоянию канцерогенеза, скорее всего, через этап дестабилизации окислительного фосфорилирования – необходимого условия для опухолевой трансформации клеток по кислородно-перекисному механизму.

Объектом липидной пероксидации может быть также однослойная липопротеидная мембрана лизосом. Её повреждением объясняются, по-видимому, некоторые факты повышения в опухолевых клетках активности лизосомных ферментов. Такие данные представлены, например, в отношении опухоли лёгкого Льюис. Специальной проверкой ранее было установлено, что этот феномен не связан с некрозом: в зонах, где его нет, активность гидролитических ферментов выше, чем в некротических участках (Dobrossy et al., 1980). Полезная в норме регуляторная роль протеолитических ферментов может привести и к патологическим изменениям в случае существенного повышения уровня и активности этих ферментов, вызванные дестабилизацией мембран лизосом. Не исключено, в частности, что разрушающее действие лизосомных ферментов касается и элементов цитоскелета. Как отмечалось в п. 2.3.4, нарушение цитоскелета вызывает уменьшение содержания фибронектина на клеточной повер-хности, снижение адгезивности и контактного торможения. Если эти и некоторые иные изменения, логично увязываемые с процессами инвазии и метастазирования, хотя бы отчасти обусловлены действием лизосомных протеаз в клетке и на её поверхности, значит уже в этом постулируемые нами внутриклеточные гипероксия и пероксидация причастны к возникновению указанных специфических свойств злокачественных опухолей. Несколько шире с привлечением и других причинных факторов вопрос об инвазивном росте и метастазировании неоплазм рассмотрен в отдельном подразделе 2.4.

2.3.9. В гипероксических и пероксигеназных условиях определённые изменения происходят и в мембранах ядерной оболочки, где выявлены богатый и своеобразный ферментативный профиль и, в частности, ферменты дыхательной цепи и ATP-аза. Наличие последних, несомненно, связано с процессами активного транспорта и окислительного фосфорилирования в ядерной оболочке, энергообеспечением внутриядерных процессов и ядерно-цитоплазматических отношений (Мирахмедов и др., 1990), которые, кстати, оказались О₂-зависи-мыми. Так, транспорт РНК из ядра в цитоплазму тормозится при снижении концентрации О₂ (Збарский, 1982). К разряду существенных эффектов в ядре, коррелирующих с содержанием О₂, относится и значительное обратимое снижение синтеза ДНК при дезоксигенации культур асцитных клеток Эрлиха, причём О₂-зависимым в репликации яДНК оказался только процесс инициации новых репликонных единиц (Probst et al., 1984).

Определённую роль в проявлении сдвигов в ферментных системах ядерной оболочки играет и АФК-продуцирующая способность электронотранспортных цепей мембран ядер (Збарский, 1982; Greenly, Davies, 1994; Пескин, 1997), кото-рая при избыточных рО₂ и ПОЛ может усугублять состояние патологичности соответствующих клеток. Показано, например, что активность цитохромоксидазы в ядрах клеток гепатомы понижена; значительно уменьшается и ATP-азная активность ядерной оболочки опухолевых клеток (Збарский и др., 1977). Эти изменения в мембранах ядра вносят, очевидно, свой вклад в перестройку энергетики клеток неоплазмы и в её последствия. Существенным, в частности, может быть изменение регуляции экспрессии генов, связанной с локальными энергозависимыми перестройками хроматина. Некоторые ферментные системы используют энергию гидролиза АТР для указанных перестроек структуры хроматина, делая её доступной для связывания факторов транскрипции (Whitehouse et al., 2000). При устойчивом дефиците АТР такая регуляция будет, естественно, отличаться от происходящей в норме (см. также ниже и п. 2.3.10).

К активному или неконтролируемому синтезу яДНК в опухолях может быть причастно изменение в них концентрации сАМР. Это вытекает из данных о существовании канала для ингибирования тимидинкиназы сАМР-зависимой протеинкиназой и, следовательно, сАМР-зависимого подавления синтеза ДНК (Кульчицкий, 1987). Известно также, что повышение уровня сАМР тормозит включение тимидина в стимулированные к пролиферации лимфоциты и подавляет активность рибонуклеотидредуктазы – фермента, ответственного за продукцию дезоксирибонуклеотидов. Осуществляемое сАМР ингибирование про-лиферации лимфоцитов на пре- и посттрансляционном уровнях характеризуется дозовой зависимостью (Albert et al., 1990). Указанный «тимидиновый» канал пока единственный из известных нам для непосредственного выхода цитоплазматического сАМР на ядерную ДНК, точнее – на процесс её образования. В таком случае снижение уровня сАМР в пролиферирующих клетках неоплазмы должно способствовать активизации биосинтеза ДНК.

По некоторым данным (Федоров и др., 1990), сАМР в комплексе с регу-ляторной субъединицей протеинкиназы А после транслокации в ядро взаи-модействует с промоторными участками генома, активируя или ингибируя экспрессию целого ряда генов. Следовательно, в трансформированных клетках при недостаточном содержании в них сАМР спектр экспрессированных генов только по этой причине будет уже аномальным. Что же касается сАМР-зависимого ингибирования пролиферации на претрансляционном уровне, то один из возможных здесь вариантов механизма, похоже, связан с действием в клетке последовательности процессов: синтез сАМР – повышение интенсивности сАМР-зависимого фосфорилирования фермента 2΄,5΄-олигоаденилатсинте-тазы – возрастание уровня 2΄,5΄-олигоаденилата – активация РНКазы – гидролиз РНК – торможение клеточной пролиферации. Повышению уровня 2΄,5΄-олиго-аденилата способствует также одновременное снижение активности гидролизирующей его 2΄-фосфодиэстеразы. Данный вариант последовательности событий подробно рассмотрен на примере воздействия интерферона на клетки NIH 3T3 (Северин и др., 1998). Как видно, здесь задействована установленная ранее Иткесом и соавт. функциональная взаимосвязь двух важнейших биорегуляторов – сАМР и 2΄,5΄-олигоаденилата. Очевидно, в условиях опухолевой клетки и этот механизм антипролиферативного действия становится нереализуемым или малоэффективным из-за низкого в ней содержания сАМР.

Согласно данным ряда исследований (Алесенко и др., 1982; Кувичкин, 2000), в образовании ДНК-мембранного комплекса участвуют фосфолипиды. Они способны оказывать регуляторное действие на функциональную активность хроматина за счёт изменения конформации ДНК, гистонов и негистоновых белков, изменения гидрофобных взаимодействий между ДНК и белками хроматина. Поскольку в S-фазу содержание фосфолипидов в ядре обычно снижается, предполагают, что они вовлечены в образование сигнальных молекул, запускающих репликацию ДНК (Fraschini et al., 1999). Подробно указанные вопросы рассмотрены в недавнем обзоре (Стручков, Стражевская. 2000), где, в частности, отмечаются и следующие моменты. Специфические ДНК-связанные липиды, среди которых нейтральные преобладают над фосфолипидами, играют важную роль в структурно-функциональной организации хромосомальной ДНК нормальных и опухолевых клеток. Состав этих липидов зависит от фазы клеточного цикла, выраженности генной экспрессии и степени малигнизации. Они участвуют в петлевой укладке ДНК, в её контакте с ядерным матриксом и являются чувствительными мишенями для ионизирующей радиации. Наряду с негистоновыми белками они же задействованы в механизм регуляции процессов репликации, репарации и транскрипции ДНК на уровнях матрицы ДНК или соответствующих ферментов.

Существенно, что в клеточных ядрах локализованы многие ферменты (фосфолипазы и др.), связанные с обменом арахидоновой кислоты, а также липидозависимая РКС, которая фосфорилирует в них регуляторные белки. Ядра, выделенные из моноцитоподобных клеток человека, содержат 22 % общей арахидоновой кислоты данных клеток, причём эта кислота присутствует в разных молекулярных формах фосфолипидов, отличных от арахидонат-содер-жащих их форм в неядерных мембранах (Surette, Chilton, 1998).

При ПОЛ регуляторное действие ядерных липидов будет, очевидно, извра-щено. Наиболее явственно это должно проявиться в случае развития в мемб-ранах радиационно-индуцированных процессов ПОЛ, когда поражение ДНК-мембранного комплекса может быть обусловлено повреждением линкеров, т.е. липидных образований, связывающих субъединицы ДНК на мембране. В результате какая-то часть субъединиц ДНК освобождается, а зависимый от состояния ядерных мембран синтез ДНК снижается (Поливода и др., 1990). В экспериментах in vitro и in vivo на белых крысах показано, что ДНК-полимеразы являются липидозависимыми ферментами. Их активность в значительной степени изменяется при модификации фосфолипидного состава ядер. Путём направленного изменения жирно-кислотного состава липидов ядерных структур установлена их корреляционная связь с изменением функционального состояния ядерного генома (Бабенко, 1984).

Среди других работ, подтверждающих участие фосфолипидов ядерных мембран в транскрипции, отметим результаты исследований Хираи с соавт. (Hirai et al., 1991). Ими показано, что хлорпромазин, верапамил, тетракаин, имипрамин, обладающие сродством к фосфолипидам, и PLA₂ ингибировали точную транскрипцию аденовируса 2 в ядерных экстрактах клеток асцитной опухоли Эрлиха. При добавлении же в среду кислых фосфолипидов активность транскрипции восстанавливалась. Хлорпромазин ингибировал транскрпицию на этапе инициации и не влиял на активность очищенной РНК-полимеразы, что предполагает взаимодействие фосфолипидов в ядерных экстрактах с факторами транскрипции. Эти данные привели авторов к выводу: фосфолипиды ядерных мембран участвуют в инициации точной транскрипции. Очевидно, при развитии в этих мембранах ПОЛ, особенно избыточного, указанная функция фосфолипидов будет нарушена, и в первую очередь это проявляется там, где отдельные факторы транскрипции, как отмечается в той же работе (Hirai et al., 1991), имеют сродство к кардиолипину.

Не исключено, что изменения во взаимодействии легкоокисляемых фосфо-липидов с некоторыми факторами транскрипции используются природой в качестве одного из регуляторных актов в переключательной транскриптоно-триггерной системе клетки. Тогда отдельные транскриптоны и целые их комп-лексы могут отключаться путём повышения ПОЛ до некоторого «расчётного» уровня (например, на этапе пролиферации) или активации PLA₂ в соответ-ствующие моменты, детерминируемые подсистемой управления клеточным циклом и программой иных подсистем генома. При этом кардиолипин и другие легкоокисляемые фосфолипиды выполняют функцию своеобразного «плавкого предохранителя»: в отсутствии указанных управляющих воздействий они сох-раняют свою целостность и участвуют в инициации транскрипции, при появлении же таковых они «перегорают», и процесс транскрипции просто не начинается.

По указанной причине и вследствие постулируемых нами устойчивых гипероксии и избыточном ПОЛ в опухолевых клетках определённая часть их генома (вероятно, какие-то подсистемы дифференцировки) окажется выключенной, что может быть одной из причин дисдифференцировки этих клеток. Если же учесть возможную тканеспецифичность рассматриваемых регуляторных «устройств» и программ переключений транскриптонов в клеточном геноме, то неизбежным будет и разнообразие структур возникающих неоплазм. К аналогичной «позиционной» регуляции причастен, по-видимому, и кардиолипин, участвующий в суперспирализации петель ДНК при вхождении клеток в интерфазу (Стручков, Стражевская, 1999). При переходе же к окислительному митогенезу способность легкоокисляемого кардиолипина удерживать петли ДНК в суперспирализованном состоянии должна утрачиваться.

Регуляторный смысл модификации фосфолипидного состава ядерных мембран за счёт пероксидации липидов, изменяющейся в норме в допустимых безопасных для клетки пределах, обосновывается работой и ряда других исследователей. В частности, Губский с соавт. (1990) сообщили, что изменение интенсивности ПОЛ в хроматине – один из факторов регуляции функциональной активности генома. Но логика этой регуляции, показанная ими на примере печени крыс, оказалась противоположной рассмотренной нами выше: интенсификация ПОЛ в хроматине совпадала по времени с его структурно-функцио-нальной перестройкой, при этом процессы ПОЛ более интенсивно протекали во фракции транскрипционно активного хроматина, чем в репрессированной фракции. С этим фактом согласуются данные о том, что как активаторы ПОЛ АФК (О , Н₂О₂) в малых неповреждающих концентрациях активируют транскрипционные факторы (Sen, Packer, 1996; см. также Меньшикова, Зенков, 1997; Пескин, 1997; Кобляков, 1998; Турпаев, 2002). В частности, накопление АФК, индуцированное обогащением клеток (фибробластов человека) различными PUFAs активирует факторы транскрипции AP-1 и NF-kB. Стимулирующий эф-фект PUFAs супрессируется антиоксидантами – витамином Е и N-ацетил-цистеином (Maziere et al., 1999).

Названные выше факты указывают на существование изначально вариантов систем регуляции с противоположными знаками выходного сигнала, адаптированные к выполнению определённых функций внутри клетки и (или) к её специализации. Вообще же, некоторые принципы реализации клеточных регуляторных систем с сигналами противоположной направленности уже известны. Таковы, например, активация и ингибирование аденилатциклазы через разные GTP-связывающие белки, стимуляция и подавление активности разных изоформ PLC кардиолипином (Wolf, 1989). А в книге (Кухарь и др., 1991) приведён перечень биорегуляторов, взаимодействие которых с различными рецепторами активирует или угнетает универсальные аденилатциклазную и полифосфоинозитидную системы. Однако поиски систем регуляции с иными принципами инвертирования выходного сигнала будут по-прежнему актуальными.

АФК, радикальные и молекулярные продукты ПОЛ способны в принципе модифицировать негистоновые белки хроматина, причастные, как принято считать, к регуляции экспрессии генов, и тем самым осуществлять не предусмотренное в норме, «незаконное» перепрограммирование генома, т. е. вести к дисфункции множества генов. Если в такой трансформации негистоновых белков есть элемент случайности, то в общем случае в разных клетках и в различное время нарушение структуры и функции будет затрагивать совершенно разные индивидуальные белки, а сама дисфункция генов будет беспорядочной. Учитывая случайность отдельных актов этого процесса в ряду поколений клеток и упомянутые выше изменения РНК-полимеразной активности при ПОЛ ядерных структур, следует ожидать проявления в динамике непредсказуемых сочетаний характеризующих неоплазии разных признаков. Данные соображения могут быть подробнее обсуждены при анализе и разработке механизма прогрессии опухолей.

2.3.10. Немало работ свидетельствуют и о наличии структурных изменений в самой яДНК и биологических эффектов, вызванных воздействием на неё радикалов О₂ и продуктов ПОЛ. АФК способны непосредственно модифици-ровать яДНК, вызывать одно- и двунитевые разрывы этой макромолекулы. В частности, радикал ОН˙ взаимодействует с дезоксирибозой, пуриновыми и пиримидиновыми основаниями ДНК (Осипов и др., 1990). АФК вызывают образование органических пероксидов ROOH, прежде всего липидов и ДНК. Возникающие затем вторичные токсические продукты повреждают мембраны, ДНК и другие биополимеры (см. Кулинский, Колесниченко, 1993). Одним из важнейших продуктов окисления ДНК является 8-OH-dG. Стационарное содержание его в яДНК млекопитающих составляет в среднем 1-3 на 10⁵ гуанинов и повышается при окислительном стрессе (Жижина, Блюхтерова, 1997).

Накопление окислительных повреждений яДНК рассматривается в числе причин сердечно-сосудистых и онкологических заболеваний. Флойд (Floyd, 1990), комментируя генотоксическую роль свободных радикалов О₂ в канцерогенезе, отмечает опосредованные ими разрывы нити ДНК и включение аддуктов оснований, которые могут вызывать искажение или снижение точности считывания ДНК. ОН˙-индуцированные повреждения ДНК встречаются до образования опухоли и, следовательно, эти окислительные модификации причинно связаны со злокачественным процессом. Подтверждение этой концепции получено при изучении английской камбалы, являющейся частью популяций с низкой встречаемостью рака печени (Malins, Haimanot, 1991).

В последующие годы подобная информация приводилась в литературе неоднократно. Так, действие свободных кислородных радикалов на геномные двухцепочечные молекулы ДНК было сопряжено с образованием 8-гидрокси-гуанина, что часто приводило к нуклеотидным заменам Г→Т. Выявление и количественный анализ индукции этого ДНК-деривата делает его информаци-онным маркёром при анализе уровней и типов мутагенеза и канцерогенеза (Kamiya, Kasai, 1995; Hirano et al., 2000). Повышенные уровни 8-OH-dG обнаружены в ДНК опухолей молочной железы человека (Malins et al., 1993). Образование этого же продукта показано при генерации АФК в ходе микросомной активации тамоксифена и 4-гидрокситамоксифена в присутствии NADPH. Эти процессы, предположительно, участвуют в канцерогенных действиях тамоксифена (Ye, Bodell, 1996).

В одной из работ (Wang, Liehr, 1995) эндогенные аддукты ДНК хомячков индуцированы гидроперекисью липидов, и в этой связи обсуждался возможный механизм канцерогенеза, обусловленный гидроперекисью. Такой эффект вызывает, в частности, образующийся при свободнорадикальном окислении PUFAs (конкретно PUFA ω-6) 4-гидрокси-2-ноненаль. Последний легко образует адду-кты д-гуанозина (Chung F. L. et al., 2000). Канцерогенными и мутагенными свойствами обладает также продукт ПОЛ MDA. Взаимодействуя с ДНК, MDA образует аддукты с д-гуанозином и д-аденозином, главным из которых является пиримидопуринон M₁G. Последний обнаружен в печени, лейкоцитах, поджелудочной и молочной железах даже здоровых людей в количествах 1 120/10⁸ нуклеотидов ДНК. Полагают, что M₁G – главный эндогенный канцерогенный ДНК-аддукт у человека, источником которого служат пищевые продукты (Marnett, 1999).

Сравнение уровня 8-OH-dG в периферической части ткани лёгкого больных раком этого органа (70 чел.) и больных без рака (15 чел.) обнаружило увеличение содержания 8-OH-dG в группе раковых больных. Это подтверждает вовлечение АФК в индукцию лёгочных неоплазм (Inoue M. et al., 1998). Подобного мнения придерживаются Фалаши с соавт. (Falaschi et al., 1997), указывая, что яДНК постоянно претерпевает модификацию под действием различных АФК и активных форм азота in vivo и что окисление/дезаминирование этой ДНК в течение жизни вносит вклад в развитие возрастного рака. Многие факты об 8-OH-dG как маркёре клеточного окислительного стресса при канцерогенезе приведены в ряде работ последних лет, в том числе обзорных (Kasai, 1997; Halliwell, 1999; Romano et al., 2000). Интересен также механизм зависимого от галоидов (HOCl, HOBr) образования ОН˙ активированными нейтрофилами и эозинофилами, приводящий к окислительному повреждению ДНК, РНК, фонда нуклеотидов и, в частности, образованию 8-гидроксигуанина в составе ДНК. Полагают, что этот новый независимый от ионов переходных металлов механизм выработки ОН˙ участвует в процессах хронического воспаления и развитии канцерогенеза (Shen et al., 2000)

В качестве биомаркёров риска развития рака рассматриваются аутоанти-тела, распознающие окисленные нуклеотиды ДНК, такие как 5-гидроксиметил-2′-дезоксиуридин. При воспалительных заболеваниях и при высоком риске развития, в частности, рака молочной железы уровень названных продуктов значительно повышается, выявляясь задолго до клинического проявления болезни (Frenkel et al., 1999). Специально отметим также существенный момент: в повреждении генетического аппарата участвуют и расположенные в непосредственной близости от него редокс-цепи ядерных мембран, образуя в ряде пос-ледовательных реакций О , Н₂О₂ и ОН˙ (Пескин, 1996).

Повреждение ДНК радикалами ОН˙ и О при канцерогенном действии радиации давно уже подтверждено экспериментально и описано в известной литературе. Есть основания считать, что действие многих химических канцерогенов на геном также опосредуется активацией в клетках процесса образования радикалов О , ОН˙ и продуктов ПОЛ – этих низкомолекулярных генотоксических факторов (Лю, Шайхутдинов, 1991; Byczkowski, Channel, 1996). Кон-центрационно-зависимые повреждения ДНК, оцениваемые по разрывам цепей, вызывались, в частности, метаболитами бензола – 1,2,4-бензтриазолом и гидрохиноном. Оба они способны образовывать О . Максимальный эффект проявлял бензтриазол, приводя к полной деградации ДНК, причём удаление из среды О , Н₂О₂ и ОН˙ оказывало защитное действие. Другие два метаболита – катехол и бензохинон – не продуцировали О и не индуцировали заметных повреждений ДНК (Lewis et al., 1988).

К существенному усилению окисления гуанина и образование 8-OH-dG в ДНК крыс приводили канцерогены метилхолантрен (см. Жижина, Блюхтерова, 1997) и N-этил-N-гидроксиэтилнитрозамин (Sato M. et al., 1998). При инкубации о-фенилгидрохинона и о-фенилбензохинона, являющихся метаболитами орто-фенилфенола, с клетками китайского хомячка линии V79 происходит значительное возрастание уровня 8-OH-dG в составе яДНК. Оба эти метаболита, вызывая однонитевые разрывы яДНК, могут обусловливать канцерогенность путём индукции выработки АФК (Henschke et al., 2000). В процессе образования опухоли на коже мышей NMPI, индуцированной диметилбензантраценом при участии форболового промотора TPA, в ДНК возникали аддукты 1,N6-этенодезоксиаденозин и 1,N2-этенодезоксигуанозин. Этот процесс тесно коррелировал с up-регуляцией метаболизма арахидоновой кислоты, катализируемого LOX (Nair et al., 2000).

Наконец, отметим здесь и следующие факты. Воздействие на эмбриональные клетки сирийского хомячка акрилонитрилом (50-75 мкг/мл в течение 7 дней), обладающего известными канцерогенными свойствами, приводило к усилению окислительного стресса и накоплению 8-OH-dG. Эти эффекты тор-мозились α-токоферолом (Zhang H. Z. Et al., 2000). Обнаружена отчётливая корреляция между опухолегенезом и образованием 8-OH-dG в ДНК клеток лёгочной ткани у мышей, которым в трахею вводили выхлопные частицы дизеля. Под действием последних в клетках лёгочного эпителия повышается образование перекисей и NO, легко превращающихся, как полагают (Sagai et al., 2000), в пероксинитрит и радикал ОН˙. Табачный дым окружающей среды на рабочих местах индуцировал окислительный стресс у работников, включая образование 8-OH-dG. Накопление последнего в крови человека коррелировало с развитием различных хронических заболеваний, в том числе рака. Под дей-ствием табачного дыма повышались также уровни активности SOD, каталазы и GPX (Howard et al., 1998). Экстракт бездымного табака (125-500 мг/кг) при-водил к возрастанию интенсивности ПОЛ в микросомах и митохондриях, экс-креции MDA и ацетальдегида с мочой, а также числа однонитевых разрывов ДНК у крыс Sprague-Dawley. Эти показатели свидетельствовали об индукции указанным экстрактом окислительного стресса и повреждении ткани у животных (Bagchi M. et al., 1998).

С окислительным повреждением ДНК связывают также уровень жировой диеты, считая такое повреждение маркёром потребления жира человеком и риска развития рака. В доказательство этого сообщается, что у женщин с высоким риском развития рака молочной железы снижение потребления жира на 43 % приводило к трехкратному уменьшению содержания 5-гидроксиметил-урацила в периферийных ядерных клетках крови, причём отмечалась линейная зависимость между потреблением жира и количеством указанного модифицированного соединения в клетках (Djuric et al., 1991). Интересно, что содержание крыс на диете, лишёной холина, приводит к липидной пероксидации во фракциях митохондрий и микросом, а также в ядрах клеток печени, с чем связаны, по-видимому, гибель некоторых печёночных клеток, повреждение ДНК и инициация гепатоканцерогенеза. При включении в рацион холина липидная пероксидация не отмечалась. Введение агента, связывающего свободные радикалы, предотвращало также пероксидацию в ядерной и других фракциях печени, вызванную диетой без холина (Rushmore et al., 1987). Позже сходные результаты получены в другой работе (Denda et al., 1998). Здесь показано, что ингибиторы каскада метаболизма арахидоновой кислоты (ибупрофен, пироксикам, ингибиторы PLA₂ и LOX) тормозили образование 8-OH-dG в составе ДНК печени крыс Fischer, развитие цирроза, пред- и неопластических узелков, индуцированных содержанием животных на рационе с дефицитом холина.

Не менее привлекательными, хотя и не совсем пока понятными, представляются материалы эксперимента на крысах, показывающие связь дефицита холина в рационе с нарушением зависимой от NADH (комплекса I) дыхательной функции митохондрий. Нарушение транспорта электронов в митохондриях коррелировало с изменениями в метаболизме фосфатидилхолина и значительным возрастанием выработки Н₂О₂ в этих органеллах, причём NADH-зависимое образование Н₂О₂ было повышено в 2.5 раза по сравнению с нормой (Hensley et al., 2000). Не исключено, что одна из причин, ведущая к проявлению указанного эффекта, состоит в возможной дестабилизации при дефиците холина фосфолипидного микроокружения в районе локализации комплекса I на внутренней мембране митохондрий. Однако, независимо от конкретного механизма нарушения дыхательной цепи холиндефицитным рационом, в митохондриях и клетке должны возникать состояние гипероксии и соответственно возрастать уровни АФК, опасные в канцерогенном отношении.

Как видно, наряду с рассмотренными выше эпигенетическими механиз-мами онкогенеза при гипероксии и избыточном ПОЛ генотоксичность АФК, проявляющаяся часто в модификации нуклеотидов и разрывах цепей ДНК (в том числе и путём активации нуклеаз), также каким-то образом «работает» на канцерогенез. Возможно, роль разрывов ДНК на отдельные фрагменты в указанных случаях сводится к созданию условий для: 1) внеплановых изменения их прежней локализации (включая увеличение возможностей и числа вариантов транслокации подвижных генетических элементов), рекомбинации и других перестроек генетического материала; 2) реализации при таких неточечных мутациях бесконтрольной экспрессии некоторых генов и транскриптонов, в частности, тех, которые определяют режим энергетического обмена и функ-ционирование подсистемы управления клеточным циклом. Не без указанных, вероятно, причин активируется синтез продуктов протоонкогенов и (или) образование специфических слитых белков. Обе эти категории белков часто относятся к факторам транскрипции, и изменение качества, содержания и времени их появления искажает «правильный» транскрипционный контроль и нормальную программу функционирования генома, что, несомненно, играет важную роль в этиологии опухолей. Кроме того, возникшие в результате хромосомных транслокаций слитые белки становятся уникальными опухолевыми антиге-нами – потенциальными мишенями для направленной терапии (Rabbitis, 1994).

Таким образом, известная способность некоторых генов индуцироваться под действием АФК, скорее всего, реализуется на транскрипционном уровне (см. п. 1.1.1). При этом происходят АФК-зависимые регуляция активности факторов транскрипции (AP-1, NF-kB и др.) и (или) изменение экспрессии этих факторов (Турпаев, 2002).

В свете изложенного выше представляются важными данные об индукции кислородными радикалами мутаций гена р53 как супрессора опухолей. Изучение влияния комбинации Н₂О₂ с FeCl₃ на мутации этого гена в культивируемых фибробластах кожи человека показало (Hussain et al., 1994): мутации происходят в кодонах 248-250 гена р53, причём спектр мутаций, вызванных радикалами О₂, соответствует спектру мутаций, индуцированных такими известными канцерогенами, как афлатоксин В1, бенз(а)пирен и гетероциклические амины. По другой информации, мутацию гена р53 в кодоне 248 индуцируют АФК совместно с соединениями, образующими NO. Это показано, в частности, на эндо-телиальных клетках бронхов человека линии BEAS 2B, которые подвергали воздействию донора NO (название приводится) и системы ксантин-ксантин-оксидаза (Souici et al., 2000). По такому механизму мутации гена р53 могут в принципе происходить и в опухолевых клетках, где для этого созданы подходящие кислородно-перекисные условия и синтезируется NO (см. п. 2.3.2). В дальнейшем мутации гена р53 в кодонах 247 и 248, обусловленные окислительным стрессом, обнаружены в ткани ободочной кишки больных язвенным колитом – хроническом воспалительном заболевании, склонном к опухолегенности. И здесь в указанной ткани больных активность NO-синтетазы была выше, чем в норме (Hussain et al., 2000).

Нам представляется, что из указанных фактов можно было бы сделать два существенных вывода: 1) по отношению к кислородно-перекисной ситуации в клетке мутации гена р53 вторичны; 2) химические канцерогены причастны к тем же мутациям косвенно, через предварительное создание ими дыхательной недостаточности и устойчивого пероксидативного состояния в клетке. Следовательно, при канцерогенезе наряду с неточечными, в основном, мутациями случайного характера в принципе возможны и точечные. Последние применительно к генам супрессии опухолей в каких-то определённых условиях (в частности, при умеренной гипероксии и пероксигенации) могут, по-видимому, возникать более или менее регулярно, способствуя развитию неоплазм. Происходящий в последние десятилетия «информационный взрыв», связанный с широкими ис-следованиями роли гена р53 и механизма действия его продукта, должен внести ясность в обсуждаемый вопрос.

Привлекает также внимание сообщение об исследованиях, в которых показано, что ДНК из клеток инвазивного и неинвазивного рака лёгкого человека различаются по числу вызванных свободными радикалами повреждений, а именно: количество их в клетках инвазивных опухолей в 2 раза больше, причём эти повреждения индуцируются радикалами (пероксидами водорода), генерируемыми самой опухолью (Raloff, 1996). Данные такого рода свидетельствуют, очевидно, о более высоком уровне пероксигенации в инвазивных новообразованиях. Образующиеся в них в избытке АФК, с одной стороны, оказывают токсическое действие на многие внутриклеточные биомолекулы, включая ДНК, а с другой – ведут к ослаблению поверхностных структур клетки и межклеточных контактов, т.е. к изменениям, причастным к инвазивности и метастазированию неоплазм (см. п. 2..4).

Приведённые в п. 2.3.9 и 2.3.10 материалы убеждают в том, что в ядре нормальных и опухолевых клеток реализуются различные АФК-зависимые процессы, связанные, в основном, с регуляцией ферментативного синтеза молекул РНК и ДНК. Проиводство АФК для этих целей, похоже, налажено и в самом ядре (см. Пескин, 1996), причём существует ядерная ферментативная антиоксидантная система, удерживающая свободнорадикальные реакции пероксигенации на необходимом сравнительно низком в норме уровне, защищая тем самым ДНК и хроматин в целом от повреждения (Emerit, 1994; Протас, 1996). О «мощности» этой относительно автономной системы можно судить, например, по тому, что в ядре сосредоточена почти третья часть основных клеточных антиоксидантных ферментов – SOD, каталазы и пероксидазы (Maestro, McDonald, 1989 – цит. по Протас, 1996). Эти ферменты отличаются от митохондриальных и цитоплазматических, а ядерная SOD ассоциирована преимущественно с транскрипционно активным хроматином (Протас, Чаяло, 1993), что косвенно указывает на причастность её к регуляции АФК-зависимого синтеза РНК.

Если в норме регуляция процессов транскрипции и репликации ДНК как-то скоординирована с действием ядерной антиоксидантной системы, то в ядре опухолевой клетки эта согласованность нарушается из-за, как мы полагаем, устойчиво поддерживаемой глобальной внутриклеточной гипероксии. Последняя, несомненно, оказывает своё негативное влияние и на ядерные процессы, в том числе на регуляторные и синтетические, увеличивая в ядре значение дисбаланса ∆ (ПО –АО) путём повышения ПО-составляющей и частичной инакти-вации АО-составляющей его.

С изложенным выше в какой-то мере связаны интригующие результаты исследований по белку BRCA1 цинковых пальцев с неизвестной ранее функцией. Оказалось, что BRCA1 может играть роль в репарации окислительных повреждений в ДНК. Недостаточность этого белка снижает эффективность репарации таких повреждений, повышает чувствительность клеток к действию ионизирующего излучения и перекисных соединений. Более того, мутации в гене BRCA1 ведут к развитию рака молочной железы и яичников (Gowen et al., 1998). Этот интереснейший факт косвенно подтверждает причастность пероксигеназного стресса к нарушению функций яДНК и к самому канцерогенезу.

В последнее время внимание исследователей привлекают также ДНК-гли-козилазы – ключевые, как считают (Рыхлевская, Кузнецова, 2000), ферменты репарации повреждений ДНК, возникающих под действием АФК. Инактивация любого из этих ферментов приводит к спонтанному появлению мутантного фенотипа. Ген ДНК-гликозилазы человека (ген OGG1) кодирует 2 формы белка, причём белок α-OGG1 локализуется в ядре, а β-OGG1 – в митохондриях (Boiteux, Radicella, 2000). Поскольку окислительные повреждения ДНК в опухолевых клетках всё-таки обнаруживаются, это указывает на то, что в них система репарации указанных повреждений становится по каким-то причинам недостаточно эффективной. По-видимому, эта система «рассчитана» лишь на умеренные уровни окислительного стресса, а при повышенном дисбалансе ∆_К (ПО – АО) она уже не справляется со своими задачами. Таким образом, в ядре существует сложная защитная система: наряду с антиоксидантной, присутствуют и другие, способные, в частности, исправлять окислительные повреждения в яДНК. В условиях же опухолевой клетки они теряют свою эффективность.

Наконец, уместно отметить, что для ранней диагностики и количественной оценки степени повреждения тканей при патологических состояниях, связанных с избыточной продукцией АФК в организме, предложен высокочувстви-тельный метод. Последний основан на включении в состав клеток исследуемой ткани ³²Р после окислительного стресса, разделении азотистых оснований этих клеток и количественном определении содержания продукта окисления гуанозина – 8-OH-dG, причём чувствительность метода составляет 1 молекулу указанного продукта на 10⁶-10⁷ остатков гуанозина в клетке (Povey et al., 1993).

2.3.11. Роль в канцерогенезе теломер и теломеразы и возможность моди-фицирующего действия на них повышенных уровней АФК и ∆ ПО – АО) в предопухолевых и опухолевых клетках – тема, как представляется нам, акту-альная, однако по ней мы не встретили какие-либо убедительные результаты, приемлемые для большинства соответствующих специалистов. По данным ряда исследований, клетки неоплазмы отличаются относительно высокой активно-стью теломеразы. Например, в одной из работ (Yang et al., 1997) активность теломеразы выявлена в 95,2 % образцов раковых тканей желудка и в 54,1 % тканей, прилежащих к опухоли, а во всех образцах нормальных тканей она не обнаружена. В другом исследовании (Hiyama et al., 1998) активность теломеразы определялась в 95 % рака молочной железы и 83 % рака органов пищеварительного тракта, причём длина теломер в них варьировала в широких пределах. По этим фактам сделан вывод о возможности выявления злокачественных и предраковых клеток при заболеваниях различных органов и тканей по активности теломеразы. В опытах на модели химического канцерогенеза кожи мышей показано, что развитие предопухолевого состояния коррелирует с постепен-ным увеличением активности теломеразы. Индукция УФ-облучением опухолей кожи у бесшерстных мышей SKH-1 также сопровождается повышением активности теломеразы на всех стадиях фотоканцерогенеза (Mukhtar et al.,1998), при-чём это повышение ассоциировано с фазой G₁ клеточного цикла (Balasubrama-nian et al., 1999). Дефицит теломеразы и дисфункция теломер у мышей, предрасположенных к раку, нарушают у них опухолеобразование, а при введении в раковые клетки теломеразной мРНК соответствующие функции и онкогенный потенциал восстанавливаются (Greenberg et al., 1999).

В опухолевых клетках человека по сравнению с нормальными повышены уровни мРНК теломеразы и самого этого фермента, что обусловлено активацией транскрипции гена теломеразы и/или возрастанием стабильности её мРНК (Yi et al., 1999). Активность теломеразы в большинстве злокачественных опухолей человека и необходимость теломеразного механизма сохранения теломер для длительной пролиферации клеток неоплазм – темы, развиваемые и рядом других исследователей (Rowley, 1998; Urquidi et al., 1998; Holt, Shay, 1999). Однако такому направлению исследований противоречат данные о том, что нокаут гена теломеразы повышает риск развития у мышей различных форм рака вследствие повышения нестабильности генома (Rudloph et al., 1999). Эти материалы – существенный аргумент в пользу существования «нетеломеразных» механизмов поддержания опухолевого роста.

Показательна и такая «деталь»: в опухолевых клетках человека позитивно регулируется ген hEST2 – гомолог генов, кодирующих каталитическую субъ-единицу теломеразы у низших эукариот (Meyerson et al., 1997). Этот ген экспрессируется в первичных опухолях, линиях раковых клеток, в обладающих теломеразной активностью тканях и при иммортализации культивируемых клеток. Напротив, ген hEST2 не экспрессируется в дифференцированных тканях, клеточных линиях с неактивной теломеразой и при дифференцировке клеток in vitro. На основании этих данных предположили, что hEST2 есть ген каталитической субъединицы теломеразы человека. По материалам другого исследования (Hahn et al., 1999), экспрессия мутантной каталитической субъединицы теломеразы человека приводит к полному ингибированию активности этого фермента, уменьшению длины теломеры, ограничению роста и времени жизни раковых клеток. Это делает теломеразу важной мишенью для антинеопластической терапии.

Однозначно сказать о механизме и факторе, приводящем к реактивации теломеразного гена или гена каталитической субъединицы теломеразы в опухолевых клетках пока преждевременно, так как они, скорее всего, множественны. В числе факторов, влияющих на активность теломеразы, указывают, например, концентрацию сыворотки в экспериментах с культурами клеток. В этом аспекте любопытна полученная из клеток аденокарциномы лёгких человека (линия А549) злокачественная сублиния A5DC7, которая обладает пониженной активностью теломеразы и повышенной скоростью укорочения теломерной ДНК (Katakura et al., 1997). При культивировании в среде с 5 %-ной сывороткой эти качества клеток A5DC7 проявляются в полной мере: они приобретают фенотип стареющих клеток и останавливаются в росте после 106 делений. Повышение же концентрации сыворотки до 10 % приводит к активации теломеразы, удлинению теломер и возобновлению пролиферации стареющих клеток A5DC7. Данный пример, как считают авторы, демонстрирует обратимость блока пролиферации в стареющих клетках и двунаправленный (по существу, двухпозиционный) принцип регуляции активности теломеразы в клетках рассматри-ваемой сублинии.

К активации экспрессии гена теломеразы в нормальных и опухолевых клетках могут быть причастны некоторые протоонкогены. Таковым, во всяком случае, считают протоонкоген c-myc (Wang J. et al., 1998). Последний усиливает экспрессию каталитической субъединицы теломеразы в фибробластах и клетках эндотелия молочной железы, увеличивая тем самым продолжительность жизни этих линий клеток. Любопытны также данные о высокой активности теломеразы в опухолевых клетках, обусловленной избыточной экспрессией в них онкобелка bcl-2 (Mandal, Kumar, 1997). Последний известен как антиапоптозное соединение, механизм действия которого пока не совсем ясен. В то же время bcl-2 обладает свойством антиоксиданта (см. п. 7.1.9). Как представляется нам, это важное качество его может иметь непосредственное отношение к повыше-нию теломеразной активности, если учесть возможное прямое или косвенное участие явно избыточного АФК в инактивации теломеразы. Логичным выгля-дит и противоположный эффект, вызываемый действием опухолесупрессорно-го белка ретинобластомы pRb. Так, в клетках плоскоклеточного рака человека уровень активности теломеразы находится в обратной зависимости от содержания белка pRb. Сверхэкспрессия последнего приводит к резкому угнетению ак-тивности теломеразы, а изменение структуры любого из доменов pRb нарушает ингибирующее действие этого белка на теломеразу (Nguyen, Crowe, 1999).

Существует, на наш взгляд, и вероятность того, что реактивация теломераз-ного гена в опухолевых клетках как-то связана с более высокими, чем просто в нормальных стареющих клетках, уровнями рО₂, АФК и ПОЛ. Действительно, известны изменение интенсивности ПОЛ в хроматине как один из путей регу-ляции функциональной активности генома и АФК-зависимая регуляция актив-ности факторов транскрипции и/или изменение экспрессии этих факторов при АФК-индуцированной перестройке генетического материала (Меньшикова, Зенков, 1997; Пескин, 1997; Flohe et al., 1997; Numazawa et al., 1997; Simon et al., 1998). Изменение качества, содержания и времени появления факторов транскрипции искажает, естественно, «правильный» транскрипционный контроль и нормальную программу функционирования генома. Косвенно влияние умеренно повышенного уровня АФК на активацию теломеразы проглядывается, на наш взгляд, в следующем факте. При исследовании на мышах с экспериментальными опухолями Colon 26, Metha A и FM3A индометацин, ингибитор синтеза простагландинов (PGs), супрессировал их рост по сравнению с контролем и снижал в них содержание PGE₂. Индометацин индуцировал также уменьшение активности теломеразы в указанных опухолях соответственно на 80, 10 и 45 %, но не оказывал влияние на теломеразную активность неопухолевой соматической ткани (Ogino et al., 1999). Можно предполагать, что, ингибируя COX-путь метаболизма арахидоновой кислоты и синтеза PGs как одного из составляю-щих окислительного митогенеза, индометацин тем самым способствует снижению «канцерогенезного» и «пролиферативного» дисбалансов ∆_К(ПО – АО) и ∆_П(ПО – АО) до уровня, при котором ПО-компонента дисбаланса уже не активирует теломеразу.

Недостаточное содержание сАМР, которое само есть результат повышен-ного уровня ПОЛ, неэффективности энергогенерирующего аппарата и к тому же является фактором пролиферации (см. п. 1.3.4 и 2.1.9), также может стать причиной аномальности спектра экспрессированных генов, поскольку данный циклонуклеотид способен в комплексе с регуляторной субъединицей проте-инкиназы А взаимодействовать с их промоторными участками (см. п. 2.3.8). Онкобелок c-src, являясь нерецепторной тирозинкиназой, тоже активирует определённые факторы транскрипции (Yu et al., 1995). Не исключено, что в опухолевых клетках по какому-то из указанных путей реактивируется и ген теломеразы.

В некоторых работах обращается внимание на парадоксальный факт: несмотря на высокую в раковых клетках активность теломеразы, длина теломерных повторов уменьшается (Kobitsu et al., 1997) и теломеры в них короткие (Ishikawa, 1997; Urquidi et al., 1998). Обратная корреляция между активностью теломеразы и длиной теломер показана, в частности, у больных с В-клеточным хроническим лимфоцитарным лейкозом (Bechter et al., 1998). Так, у этих больных теломеры короче 6,0 т.п.н. ассоциировались с высокой теломеразной активностью, а при длине теломер > 6,0 т.п.н. – в основном с низкой активностью фермента (Р < 0,001). Кроме того, короткие теломеры и высокая активность теломеразы связывались с более низкой средней выживаемостью, что привело к мнению считать активность теломеразы прогностическим маркёром при указанной болезни. Сходные результаты получены при исследовании злокачественных опухолей мозга человека (Hiraga et al., 1998). Здесь также средняя длина терминальных теломер была значительно короче у опухолей с теломеразной активностью, чем у тех, где она отсутствовала. В целом высказано мнение, что теломеразная активность может быть показателем потенциальной или выраженной злокачественности нейроэпителиальных опухолей мозга.

Одно из возможных объяснений приведённых фактов видится в сказанном выше о месте и роли повышенной концентрации АФК в теломерной концепции. С одной стороны, АФК, похоже, причастны к усилению в опухолевых клетках экспрессии гена теломеразы, но с другой – способствуют укорочению теломер, т.е. в данном случае вторая из названных функций АФК «дискредитирует» первую, сводя её результаты почти на нет. В зависимости от соотношения этих, по сути, противоположных действий АФК могут сложиться разные ситуации, в том числе и «неопределённые», как, например, в случае, описанном в работе Леви и соавт. (Levy et al., 1998). Здесь не обнаружена статистически достоверная корреляция между длиной теломер и возрастом как здоровых женщин, так и раковых больных. Старение некоторых тканей (эпителиальных и др.) in vivo не сопровождается укорочением теломер (Kang et al., 1998). По тем же, вероятно, причинам фиксируются и другие факты, склоняющие к мнению: активность теломеразы не всегда (не обязательно) заключает в себе поддержание теломер и бессмертие соответствующих клеток (Ouellette et al., 1999).

Загадочными пока кажутся и данные о том, что некоторые клеточные линии, производные от раков человека, не содержат теломеразы, а их хромосомы имеют удлинённые теломеры (Ezzell, 1995). Сходная информация получена в исследованиях, согласно которым восстановление длины теломер не всегда происходит с участием теломеразы (см. обзор: La Torre et al., 1997; Morii et al., 1997). В этом аспекте любопытны также данные о функции поли (ADP-ри-боза)полимеразы (PARP) в контроле длины теломер и стабильности хромосом. Как отмечают авторы (Di D′adda et al., 1999), PARP участвует в репарации повреждений ДНК и подавлении процессов рекомбинации концов ДНК, и тело-меры как природные концы хромосом являются поэтому потенциальными мишенями для PARP. У мышей с инактивированным геном PARP теломеры короче, чем у мышей дикого типа, но теломеразная активность в мутантных фибробластах in vitro не изменена. Эти факты особенно существенны в свете данных о снижении в период репликативного старения активности систем репарации ДНК, в том числе PARP (Salminen et al., 1997). Возможность регуляции длины теломер по механизму, независимому от теломеразной активности, указывает на ещё более сложные механизмы старения и малигнизации клеток, чем это постулируется теломерной теорией.

2.3.12. С гипероксическими условиями в опухолевых клетках коррелируют большое содержание и резко увеличенный в них синтез PGs, особенно Е ряда (Игнатович, Фрейманис, 1990; Hashimoto, 1998; Mohammed et al., 2001). Напомним, что все известные в настоящее время 10 типов PGs имеют циклопен-тановое кольцо, несущее кислородсодержащие функциональные группы. В зависимости от числа двойных связей в боковых цепях молекулы PGs подраз-деляются на три серии, обозначаемые подстрочными индексами 1, 2 и 3. В организме животных и человека эти биорегуляторы синтезируются из PUFAs с длиной цепи 20 углеродных атомов. Важнейшим биосинтетическим предшественником PGs является арахидоновая кислота, которая высвобождается при гидролизе содержащих её фосфолипидов под действием PLA₂.

Превращение свободной PUFA в PG требует присутствия О₂, две молекулы которого включаются в одну молекулу кислоты по свободнорадикальному механизму. Очевидно, при гипероксии этот процесс протекает более интенсивно. Увеличение уровня PGs серии Е (PGE) активирует аденилатциклазу, повышает концентрацию сАМР и подавляет рост опухолевых клеток (Anderson, Crowle, 1982). Однако принципиально эти эффекты PGE в трансформиро-ванных клетках лимитируются тем, что активность их аденилатциклазы и её чувствительность к стимуляции PGs понижены. Вероятно, поэтому в клетках гепатомы Йошида PGE₂ не оказывает влияния на уровень сАМР (Trevisani et al., 1980). К увеличению синтеза PGs в опухолевых клетках может иметь отношение продуцируемый ими же NO, который, по некоторым данным (McDaniel et al., 1996), сдвигает равновесие метаболизма арахидоновой кислоты в сторону простагландинсинтетазы, ингибируя образование продуктов LOX.

Причиной усиления синтеза PGs в клетках может быть также антиокси-дантная недостаточность в них, обусловливающая пероксидантное состояние. Например, при дефиците витамина Е у крыс синтез PGE₂ и PGF_2α в их семенниках повышается в 20 раз, а содержание PGE₁, PGE₂ и PGF_2α в плазме крови обратно пропорционально концентрации токоферола. Полагают, что витамин Е тормозит синтез PGs на стадиях образования свободных перекисных радикалов арахидоновой кислоты (Machlin, 1978). В опухолевых клетках указанная ситу-ация усугубляется, так как при повышенном в них уровне ПОЛ активные липидные радикалы наряду с окислением белковых и небелковых SH-групп разрушают некоторые обладающие антиоксидантными свойствами витамины и гормоны. Поскольку эти соединения сами по себе необходимы для нормального протекания внутриклеточных процессов, снижение их содержания может иметь значительные биологические последствия. Одно из них как раз и связано с усилением продукции PGs в условиях недостаточности антиоксидантов.

Кудрявцев (1988), анализируя в своей обзорной работе роль эйкозаноидов в процессах злокачественного роста, приводит ряд интересных фактов. Напри-мер, высокие концентрации PGs обнаруживаются не только в опухолевой ткани больных, но и в плазме крови, моче, злокачественных выпотах, причём содержание PGs в крови по мере удаления кровеносных сосудов от опухоли сущес-твенно снижается. Преобладающей формой эйкрзаноидов в ткани неоплазмы чаще всего является PGE₂, концентрация которого иногда в 40-100 раз превышает уровень других эйкозаноидов. А наблюдающееся в биоптатах некоторых опухолей высокое содержание PGF_2α связывают с превращением в него PGE₂ с помощью 9-кето-редуктазы. Кстати, в большинстве случаев PGF, частности PGF_2α, в отличие от PGE проявляют митогенный эффект. Они, как полагают (см. Кухарь и др., 1991), взаимодействуют с рецептором, связанным с полифосфоинозитидным каскадом, а внутри клеток (например, Swiss 3T3) перед вступлением их в митотический цикл индуцируют экспрессию мРНК и белка циклина D1 (Sauane et al., 2000). В условиях in vitro опухолевые клетки сохраняют способность к повышенному биосинтезу PGs и секреции их в значительных количествах в культуральную среду.

Избыточная выработка PGs, в свою очередь, определяет ряд серьёзных нарушений в опухолевом организме. Так, твёрдо установлено подавление противоопухолевого иммунитета PGs серии Е. Высокая концентрация PGE₂ в опухолевой ткани ингибирует цитотоксичность макрофагов и естественных киллерных клеток (NK-клеток), низкая же концентрация, напротив, активирует их цитотоксичность (Матвеева и др., 1993; Hubbard, Erickson, 1995). PGE₁ угнетает хемотаксис, фагоцитоз и образование АФК нейтрофилами человека (Mikawa et al., 1994). Во всех этих случаях, с учётом других известных фактов (см. п. 2.1), иммунодепрессивный эффект может быть следствием последователь-ности процессов: быстрые синтез и секреция PGs клетками неоплазмы – акти-вация ими аденилатциклазы в NK-клетках и активированных фагоцитах – усиление синтеза сАМР в этих клетках – стимуляция в них сАМР-зависимого митохондриального дыхания и потребления О₂ – уменьшение рО₂ внутри эффекторных клеток – снижение ими продукции АФК и перекисных соединений – проявление эффекта иммунодепрессии. Независимо и в параллель с указанным механизмом подключается, вероятно, и другой: инактивация NADPH-оксидазы сАМР-зависимой протеинкиназой и гашение «респираторного взрыва» фаго-цитов (McPhail, Snyderman, 1984).

Под влиянием PGE₂ практически одновременно с аденилатциклазой активируется также 5′-нуклеотидаза (Балицкий и др., 1991) – фермент клеточной поверхности с характеристиками интегрального мембранного белка, ответственный за гидролиз внеклеточного AMP и транспорт образующегося аденозина в клетку. Аденозин же известен тем, что увеличивает содержание сАМР в клетках многих типов и ингибирует функциональную активность иммунокомпетентных клеток, в том числе Т-лимфоцитов и мононуклеарных фагоцитов (Si et al., 1997; Xaus et al., 1999). Поэтому вполне реальным представляется функционирование наряду с указанным выше ещё одного механизма противодей-ствия опухолевых клеток эффекторным, а именно: синтез клетками неоплазмы PGEs – активация 5′-нуклеотидазы на поверхности NK-клеток и макрофа-гов – повышение в них уровня аденозина и сАМР – подавление активности NK-клеток и макрофагов, в том числе продукции ими АФК.

С позиций указанных механизмов причастность высоких уровней PGEs к процессу развития, например, рака желудка человека в качестве одного из непосредственных факторов этого патогенеза (Степанов, 1999) представляется несколько сомнительной. Скорее всего, PGEs способствуют развитию неоплазм косвенно через иммунодепрессию, а ингибитор синтеза PGs индометацин сни-жает подавляющее их действие на иммунный ответ организма-хозяина, длительно поддерживает цитотоксическую активность мононуклеарных фагоцитов и NK-клеток. С данной точки зрения возможна интерпретация таких, в частности, фактов. Если при скармливании природным канцерогеном 1-гидроксиан-трахиноном опухоли толстой кишки возникали у 44 % крыс-самцов, а опухоли желудка – у 52 %, то добавление к канцерогенной диете индометацина приводило к следующему: опухоли толстой кишки не наблюдались вообще, частота же опухолей желудка снижалась до 14 %. Кроме того, индометацин полностью подавлял возникновение гапатом, индуцируемых канцерогеном. (Tanaka et al., 1991). В исследованиях на мышах с экспериментальными опухолями Colon 26, Metha A и FM3A индометацин (доза 1 мг/кг, 2 раза в день) значительно снижал содержание PGE₂ и супрессировал рост всех трёх опухолей по сравнению с необработанным контролем (Ogino et al., 1999).

Скармливание хомячков, носителей меланомы, индометацином с питьевой водой приводило к увеличению цитотоксической активности NK-клеток крови и понижению частоты возникновения метастазов почек (Bigda, Mysliwski, 1998). Добавление к такой же воде для мышей С57/В16 индометацина в концентрации 2 мг/мл в течение 4 дней вызывало снижение продукции PGE₂ в изолированных и культивируемых срезах мозга с 98,6 до 57,6 пг/мг и активацию микроглии, т. е. в данном случае даже в неопухолевых тканях. Считают, что именно ингибирование синтеза PGE₂ под действием индометацина приводит к активации иммунной системы мозга (Prechel et al., 2000). В перитоне-альных и альвеолярных макрофагах мышей с метастазирующей карциномой лёгких Льюис активность 5′-нуклеотидазы и концентрация аденозина возрастали по сравнению с контролем, что подавляло фукнциональную активность мак-рофагов. Подобное изменение в обмене аденозина обнаружено и в альвеолярных макрофагах больных раком лёгкого. Введение же мышам с карциномой Льюис активатора макрофагов (бактериального эндотоксина E. coli липополи-сахаридной природы) приводило к значительному торможению роста мета-стазов и восстановлению нарушенного обмена аденозина в перитонельных и альвеолярных макрофагах (Уманский и др., 1988).

Рассмотренные выше механизмы иммунодепрессорного действия PGEs и других факторов, повышающих уровень сАМР, в какой-то степени реализу-ются, по-видимому, и на эффекторных клетках специфического противоопу-холевого иммунитета. Поэтому в целом представление о существовании «простагландинового» механизма защиты опухолевых клеток от атак эффекторных клеток не лишено оснований.

Наконец, определённый интерес вызывает недавняя публикация о способности простагландинов серии J₂ (PGJ₂), являющихся производными PGD₂, действовать как индукторы окислительного стресса. Прооксидантный эффект их в отношении, например, клеток нейробластомы SH-SY5Y человека проявлялся в том, что снижались активность GPX, концентрация GSH и мембранный потенциал митохондрий, накапливался продукт ПОЛ 4-гидрокси-2-ноненаль. N-ацетилцистеин же ингибировал стимулированную PGJ₂ генерацию АФК (Kondo et al., 2001). С точки зрения кислородно-перекисных концепций канцерогенеза и апоптоза, PGJ₂ в указанном качестве может способствовать апоптозу А1 или опухолевой трансформации нормальных клеток, а в опухолевых – поддерживать «канцерогенезный» уровень дисбаланса Δ_К (ПО – АО) или повысить в них этот дисбаланс до индуцирующего апоптоз А2 (см. п. 7.1).