Регуляторные аспекты клеточной пролиферации, опухолевой промоции и канцерогенеза

Несмотря на достигнутый в последние десятилетия определённый прогресс, большинство основных вопросов, касающихся механизмов регуляции пролифе-рации и феномена опухолевой промоции, остаются без удовлетворительного ответа. Между тем пролиферация – необходимое условие для канцерогенеза, промоторы же, наряду с проявлением митогенных свойств, вызывают с боль-шой частотой предопухолевые изменения в определённых типах клеток, а при продолжительном и непрерывном воздействии – и сам канцерогенез. Выясне-ние механизма действия промоторов в этой триаде процессов приобретает не менее важное значение, чем «чисто» митогенных и канцерогенных факторов.

Среди опухолевых промоторов давно уже привлекают повышенное внима-ние исследователей форболовые эфиры. Они почти не индуцируют опухоли, но вместе с инициирующими веществами, применяемыми в субканцерогенных до-зах, приводят к образованию неоплазм. Наиболее известны и активны из этого класса соединений 12-О-тетрадеканоил-форбол-13-ацетат (TPA) и форболми-ристатацетат (PMA). Другая группа опухолевых промоторов представлена индукторами семейства цитохрома CYP (Кобляков, 1998), механизм действия которых отличается от такового форболовых эфиров.

В данной главе мы попытались, используя системный подход, рассмотреть некоторые известные в медико-биологической литературе факты и понять их в рамках отстаиваемой нами кислородно-перекисной модели промоции и канце-рогенеза, как связанных между собой процессов, индуцируемых в клеточной мембране и внутри клетки при воздействии стимуляторов роста и опухолевых промоторов. При этом нас больше привлекали кибернетические аспекты этих проблем: элементы систем и принципы биорегуляции митогенеза и опухолевой промоции, вопросы генерации первичного митогенного сигнала, его преобразо-ваний и реализации, а также регуляции активности некоторых определяющих эти процессы ферментов. Особое внимание уделено биоэнергетическим аспек-там регуляции клеточной пролиферации и дифференцировки.

Отметим, что в последние 10-20 лет интерес исследователей к проблеме опухолевой промоции заметно снизился. Уменьшилось соответственно и число публикаций по этой тематике по сравнению с таковым, например, в 1980-1992 годах.

3.1. Сходство направления изменений при стимуляции клеток опухолевыми промоторами и канцерогенезе

К настоящему времени накоплено уже немало фактов проявления на кле-точном и субклеточном уровнях различных эффектов TPA и других эфиров форбола. Анализу и систематизации этих данных было посвящено значительное количество обзорных статей и разделов в монографиях. Хорошое впечатление оставляет, в частности, книга «Химия биорегуляторных процессов» (авторы Кухарь и др., 1991), в которой, кроме того, подробно рассмотрены биорегуля-торные стереотипы на разных уровнях биологической организации и рациона-льная систематизация физиологически активных веществ. Общими свойствами форболовых эфиров как стимуляторов роста и опухолевых промоторов явля-ются обратимость эффекта, необходимость многократной аппликации, отсут-ствие или слабые канцерогенность и мутагенность, влияние на мембраны, чув-ствительность к гормонам и активность иммунитета, имитация (замещение) действия естественных факторов роста и др.

Особый интерес вызывает сходство направления изменений при стимуля-ции промоторами тканевых клеток и при опухолевой трансформации, поско-льку изучение этого сходства и указанных выше эффектов необходимо прежде всего для понимания механизма самих фундаментальных процессов клеточной пролиферации и канцерогенеза. Важную роль при этом должно сыграть пост-роение обоснованной модели ростстимулирующего действия промотров. Ско-рее всего, промоция и TPA- и PMA-зависимые изменения в клетках – события одного или близкого порядка, базирующиеся на некоторых общих начальных процессах и потому отражающие сходство направления изменений.

3.1.1. В указанной примерно постановке эти вопросы были уже рассмот-рены в наших обзорно-теоретической статье (Лю, 1986) и монографии (Лю, Шайхутдинов, 1991). Поэтому здесь с учётом новых фактов они изложены кра-тко с целью дополнительного обоснования ключевой роли АФК и АФК-зави-симых процессов в промоции и затем в канцерогенезе – положения, поддержан-ного ранее и в ряде других известных работ (Perchelett, Perchelett, 1989 и др.).

В отличие от инициаторов канцерогенеза, которые могут связываться с вну-триклеточными мишенями, TPA и иные промоторы действуют в основном на поверхность плазматической мембраны, вызывая изменения в клеточном мета-болизме, межклеточных связях, мембранном транспорте, во взаимодействии факторов роста и гормонов с их рецепторами. Обладающие высоким сродством к TPA рецепторы обнаружены во всех видах от губок до человека и в самых различных тканях. С другой стороны, форболовые эфиры связываются с фосфо-липидо- и Са²⁺зависимой PKC и прямо активируют её. Активация PKC рассмат-ривается как необходимое условие трансмембранной регуляции клеточных функций и пролиферации под действием стимуляторов роста и, в частности, опухолевых промоторов, в проявлении многочисленных их эффектов.

Форболовые эфиры в отличие от таких внеклеточных стимуляторов, как гормоны, нейромедиаторы, ростовые факторы, индукторы секреции и другие биологически активные вещества, активируют PKC без предварительной сти-муляции кругооборота инозитсодержащих фосфолипидов. В то же время фор-боловые эфиры с помощью PKC способствуют фосфорилированию инозитли-пидов в различных клеточных системах, и это их действие принимается как ключевое событие. Данный эффект индуцируется промоторами, по-видимому, косвенно через активацию ими фосфатидилинозиткиназ. В такой роли может, в частности, выступать онкобелок src. В эксперименте in vitro с линией RBL-2H3 тучных клеток, сверхэкспрессирующих PKC-δ, последняя ассоциируется с src. Следствием образования этого комплекса является стимуляция фосфорилиро-вания по серину src-киназы и её активности, ускорение клеточной пролифера-ции (Song et al., 1998). Образование комплекса активной формы белка src с PKC-δ происходило и при обработке форболовым эфиром клеток линии MCF-7 (Shanmugam et al., 1998).

Наряду с PKC TRA и сходные с ним соединения активируют ряд других ферментов, в частности, фосфолипазы С и А₂ (PLC, PLA₂). С действием этих липаз связаны такие эффекты, как гидролиз полифосфоинозитидов (PPI) с образованием инозиттрифосфата (IP₃) и диацилглицеридов (DAGs), метаболизм последних и высвобождение из мембранных фосфолипидов арахидоновой кис-лоты – предшественника PGs и тромбоксанов. Форболовые эфиры, не являю-щиеся промоторами, не проявляют таких эффектов. Прямых и косвенных под-тверждений на этот счёт получено достаточно.

Обмен фосфатидилинозитида (PI) и увеличение содержания DAG в покоя-щихся клетках стимулируют многие обладающие митогенным свойством аген-ты, активируя сопряжённую с соответствующими рецепторами PLC – ключевой фермент PPI-каскада, генерирующего вторичные мессенджеры. Разнообразие изоформ этого фермента объясняет тот факт, что он опосредует действие очень разных агонистов. PLC-β активируется гормонами, рецепторы которых сопря-жены с G-белками, а PLC-γ опосредует действие факторов роста (Rhee, Chou, 1992). Сверхэкспрессия PLC-γ в клетках NIH 3T3 промотирует трансформацию и туморогенность. Более того, экспрессия и активация PLC-γ повышаются во многих опухолях человека (Smith et al., 1998). Связывание EGF и фактора роста из тромбоцитов (PDGF) с их рецепторами приводит к образованию в мембране комплексов между этими рецепторами, цитоплазматический домен которых обладает свойствами тирозинкиназы, и PLC-γ. Фосфорилирование же послед-ней активирует гидролиз PPI. Ингибиторы тирозинкиназ устраняют активацию PLC-γ факторами роста (Ткачук, 1998). Считают, что рецепторы PGE_2α, который в клетках 3Т3 повышает активность PKC, стимулирует фосфорилирование бел-ка 80 кД и резко усиливает синтез ДНК (Goin, de Asua, 1992), также сопряжены с PLC (см. Кухарь и др., 1991).

DAG и, вероятно, другие естественные физиологические мессенджеры группы DAGs как продукты ферментативной деградации PPI могут выполнять роль эндогенных лигандов для рецепторов форболовых эфиров, но не способ-ны, по-видимому, конкурировать с последними за широкие участки связывания с PKC. Взаимодействие молекул эфиров с PKC «затрагивает значительно более обширные по сравнению с DAG области молекулы энзима и вызванная ими активация является необратимой» (Кухарь и др., 1991). Активируя PKC, DAG подобно форболовым эфирам стимулирует синтез ДНК и деление клеток. С регуляторной точки зрения здесь важен сам факт образования в плазматической мембране стимулированных клеток эндогенных лигандов, способных служить на непродолжительный период положительной обратной связью в сигнальной PPI-системе. Предполагается, что PKC, кооперативно управляемая тремя факто-рами – DAG, Са²⁺ и фосфатидилсерином (PS), образует с ними активный ком-плекс со следующей стехиометрией (Edelman et al., 1987):

[PKC] [DAG] [Ca²⁺] [PS]₄.

На основании последних данных о молекулярном механизме регуляции функции PKC мессенджером DAG предложена модель такой регуляции, где, в частности, рассмотрена роль доменов С1 и С2 этого фермента в связывании его с мембранами. Отмечается, что такое связывание приводит к высокоаффинному взаимодействию, которое зависит от присутствия DAG и PS и обеспечивает сверхчувствительность в активации PKC (Newton, Johnson, 1998). А исследова-нием регуляции PKC со стороны PS было установлено: специфические молеку-лярные детерминанты на PKC стереоспецифически узнают структурные детер-минанты на PS. В частности, PKC-βII специфически узнаёт 1,2-sn-фосфатидил-L-серин независимо от структуры мембраны (Johnson et al., 1998).

Наряду с фосфолипидозависимой регуляцией активности PKC существуют и другие варианты, связанные с наличием изоформ PKC. В обзоре Ткачука (1998) со ссылкой на соответствующие источники известные на сегодня изо-ферменты PKC подразделены на три группы: ферменты, регулируемые Са²⁺ и DAG; регулируемые только DAG; нерегулируемые ни одним из этих вторичных мессенджеров (Hug, Sarre, 1993). Первую группу изоформ PKC стимулируют продукты распада IP₃, фосфорилированного по положениям 1, 4 и 5; активацию второй группы изоформ вызывает гидролиз фосфатидилхолина липазами PLC и PLD, а третья группа изоформ PKC регулируется IP₃, содержащим фосфат в положениях 3, 4 и 5 инозита (Nakanishi et al., 1993). По другим данным (Gschwendt, 1999), 11 изоферментов PKC отнесены к группам: Са²⁺-зависимые, активируемые DAG (PKC-α, -β₁, -β₂, -γ); Са²⁺-независимые и DAG-активиру-емые (PKC-δ, -ε, -η, -θ, -μ); Ca²⁺-зависимые и не активируемые DAG (PKC-ζ, -λ). Наиболее изученным считается PKC-δ.

К числу независимых от мембранных липидов PKC относят PKC-α, кото-рую форболовые эфиры и DAG, в отличие от других изоформ PKC, ингиби-руют (Slater et al., 1998). Называют и другую особенность PKC-α: фосфори-лируя PLC-β₁, она подавляет её активность, а субъединицы β и γ G-белков противодействуют этому и даже стимулируют указанную активность (Litosch, 1997). По PKC-θ установлено, что она необходима для дифференцировки, например, клеток LAN-5 нейробластомы человека. Во всяком случае, под дейс-твием ретиноевой кислоты PKC-θ в этих клетках усиленно экспрессируется как ядерный и околоядерный белок, антисмысловые же олигонуклеотиды к PKC-θ ослабляют как экспрессию этого изофермента, так и ответ клеток на стимуля-цию дифференцировки ретиноевой кислотой (Sparatore et al., 2000). Кстати, дифференцировку может индуцировать и РКС-ζ – новый член семейства РКС, который не связывает Са²⁺, не активируется DAG и форболовыми эфирами, но способен влиять на определённые процессы, в частности, на инсулинозависи-мый синтез белка и функцию актинового цитоскелета (Liao, Guan, 2002). Счита-ется, что специфичность изозимов PKC связана с различной субклеточной их локализацией. При активации этих изоферментов липидными вторичными мес-сенджерами они транслоцируются из одного клеточного компартмента в дру-гой. Предположительно, специфичность изозимов PKC опосредуется белок-бел-ковыми взаимодействиями их доменов со специфическими заякоривающими белками (Mochley-Rosen, Gordon, 1998).

Совершенно новые возможности для регуляции возникают также в связи с данными о том, что арахидоновая и другие свободные ненасыщенные жирные кислоты непосредственно активируют различные изоформы PKC независимо от DAG, PS и Са²⁺. Однако по отношению к PLA₂ такие кислоты, особенно арахидоновая, проявляют ингибиторный эффект, что можно рассматривать как регуляцию активности PLA₂ по принципу отрицательной обратной связи, ограничивающей образование полиненасыщенных жирных кислот (PUFAs) и, следовательно, оксилипинов (см. обзор: Когтева, Безуглов, 1998).

Активация при промоции липооксигеназ (LOXs), участвующих в выработке митогенного сигнала (Timar et al., 2000), – процесс также не случайный. TPA приводит к значительному возрастанию ферментативного окисления арахидо-новой кислоты с образованием 5- и 15-моногидроксиэйкозатетраеновых кислот. Способность эта соответствует способности TPA стимулировать рост опухолей кожи мышей, причём ингибиторы LOXs препятствуют проявлению действия TPA (Nakadate, 1989). Форболовый эфир индуцирует также циклооксигеназу (COX). Так, обработка им клеток эпителия рта и молочной железы человека заметно увеличивала синтез COX-2 и PGE₂. Фенольный антиоксидант ресве-ратрол, найденный в винограде и вине, ингибировал эти эффекты и опосредо-ванную эфиром форбола активацию PKC. Он же напрямую ингибировал актив-ность COX-2 (Subbaramaiah et al., 1998).

Большинство опухолевых промоторов (если не все) может приводить к образованию в различных мембранных структурах свободных радикалов, инду-цировать в них генерацию АФК и интенсивное ПОЛ. Так, через 2 ч после введения в/б TPA (0,1 мкг) мышам Swiss-Webster интенсивность ПОЛ в мито-хондриях и микросомах печени и гомогенатах мозга была повышена в 2,6, 2,8 и 3,0 раза соответственно. Предварительное введение в течение 3 дней антиокси-дантов Zn-L-метионина, Zn-DL-метионина или витамина Е снижало интенсив-ность ПОЛ в митохондриях на 35-37 %, а в гомогенатах мозга – на 32-46 % (Bagchi et al., 1998). Силимарин – флавоноидный антиоксидант, выявленный в Silybum marianum, при нанесении на кожу мышей до воздействия TPA показал высокую степень защиты от промотирования опухоли, индуцированной 7,12-диметилбензантраценом. При дозах 3, 6 и 12 мг силимарин уменьшал частоту возникновения неоплазмы соответственно на 25, 40 и 75 %. В других исследо-ваниях он существенно ингибировал ПОЛ и гиперплазию эпидермиса, а также синтез ДНК (Lahiri-Chatterjee et al., 1999). Электронно-микроскопическое иссле-дование клеток мозга мышей BALB/c, которым в/б вводили PMA (0,1 мг/кг), показало, что уже однократное введение его приводило к разрушению мито-хондриальных крист и к расширению эндоплазматического ретикулума. При хроническом же воздействии этим агентом отмечена, в частности, конденсация хроматина нейронов. Биохимические и ультраструктурные изменения мозга здесь связывают с индуцированной форболовым эфиром генерацией свободных радикалов (Bozkir et al., 1998).

Опухолепромоцирующими свойствами обладают также некоторые органи-ческие перекиси и гидроперекиси. Последние, являясь активаторами 5-LOX (Кулинский, Колесниченко, 1993), реализуют одну из положительных обратных связей по поддержанию состояния пероксигенации при опухолевой промоции. Продукты метаболизма арахидоновой кислоты по 5-LOX-пути поддерживают пролиферацию и рост также раковых клеток, причём этот эффект предотвра-щают ингибиторы 5-LOX, но не ингибиторы 12-LOX (Chosh, Meyers, 1997). С указанными фактами коррелируют сведения о том, что TPA – стимулятор в клетках, например, мышиного эпидермиса хемилюминесценции, которая угне-тается SOD и соединениями с подобной ей активностью. Уровень хемилюми-несценции снижают также ингибиторы LOXs и COXs. К увеличению хемилю-минесцентного свечения приводят и другие опухолевые промоторы, в том числе бензоилпероксид при однократной аппликации его на участок выбритой кожи мышей SENSAR. Во всех случаях Cu-(3,5-диизопропилсалицилат)₂, обла-дающий подобной SOD активностью, эффективно подавляет хемилюминес-ценцию, а фенольные антиоксиданты бутилоксианизол и ионол блокируют све-чение частично (Duran, de Rey, 1991).

Не остаётся вне влияния опухолевых промоторов и пероксисомальная окис-лительная система. Например, в экспериментах по изучению действия TPA на активность метаболизма липидов в печени крыс Wistar показано, что TPA уси-ливает в 2 раза β-окисление жирных кислот в пероксисомах. Действие промо-тора на метаболизм липидов подобно эффекту дефицитной по холину диеты или этионина, но не пролифераторов пероксисом. Вероятно, TPA селективно стимулирует активность пероксисомальных ферментов, осуществляющих окис-ление указанных жирных кислот (Aarsaether et al., 1990).

Опухолевые промоторы, создавая оксидативные условия, вызывают в коже мышей раннюю воспалительную реакцию (Nakadate, 1989), причём степень выраженности последней коррелирует с чувствительностью тканей к промо-торному действию TPA. Под влиянием тех же промоторов в накапливающихся в очаге воспаления полиморфноядерных лейкоцитах и макрофагах происходит известный «окислительный взрыв», сопровождающийся продукцией таких АФК, как О , Н₂О₂, ОН˙ и ¹О₂, и окисленных метаболитов арахидоновой кис-лоты. Вещества, не обладающие опухолепромоцирующими свойствами, не вы-зывают в указанных фагоцитах продукции АФК.

Считается доказанным, что «окислительный взрыв» индуцируется с по-мощью PKC. Последняя активирует NADPH-оксидазу, ответственную за про-изводство О в плазматической мембране (Babior, 1999), которое зависит от количества NADPH в клетке и, следовательно, от активности гексозомоно-фосфатного шунта. Стимуляция окислительной вспышки требует поддержания в клетках достаточного уровня DAG и активности PKC. Интересно, что в образовании О активированными макрофагами печени участвует лишь β-изо-форма PKC из 5-ти идентифицированных в них (Duyster et al., 1992). Такое же мнение высказано по результатам TPA-стимулированного образования О в полиморфноядерных лейкоцитах (Hynes et al., 1995) и стимуляции NADPH-оксидазы в нейтрофилах разными агонистами, причём активация оксидазы сопровождается и зависит от фосфорилирования цитозольного её компонента – p47^hox (Reeves et al., 1999).

Способность форболовых эфиров и, в частности, PMA стимулировать обра-зование О мышиными перитонеальными макрофагами коррелирует с их спо-собностью индуцировать высвобождение ³Н-арахидоновой кислоты. Продукция О потенцируется именно арахидоновой кислотой, поскольку добавление низ-ких концентраций её (1-10 мкМ) in vitro к указанным макрофагам, обработан-ных низкими дозами PMA (1 нг/мл), вызывало 2-кратное повышение количе-ства О в сравнении с действием одного этого промотора (Czerniecki, Witz, 1989). Данный эффект арахидоновой кислоты объясняется тем, что она может непосредственно активировать PKC (Nakamura, Nishizuka, 1994), и это подтвер-ждено материалами недавнего обзора (Когтева, Безуглов, 1998). Ингибиторы PKC, естественно, подавляют «окислительный взрыв».

Таким образом, в механизме опухолевой промоции наряду с кислородными радикалами и продуктами ПОЛ «собственного» производства определённую усиливающую роль, вероятно, могут играть такие же агенты, дополнительно образуемые привлечёнными в очаг воспаления фагоцитирующими клетками.

3.1.2. Показано также, что TPA и некоторые другие форболовые эфиры изменяют уровень циклических нуклеотидов в клетке, при этом содержание cAMP, как правило, уменьшается, а cGMP – увеличивается. Механизмы, при-водящие к данным эффектам, различны, и в определённой степени связаны с тем, что в ростстимулированной клетке активируются PKC, сигнальная PPI-сис-тема и окислительный митогенез, энергетический же обмен ослабляется. Влия-ние промоторов на уровень cAMP может быть обусловлено десенсибилизацией ими соответствующих рецепторов. Форболовые эфиры в связи с активацией PKC могут стимулировать фосфорилирование рецепторов некоторых гормонов, что приводит к снижению чувствительности сопряжённой с ними аденилатцик-лазы и падению уровня cAMP. TPA уменьшает образование cAMP, стимулиро-ванное PGE₂, путём снижения чувствительности его рецепторов в клонируемой остеобластоподобной линии клеток МОВЗ-4, причём снижается только срод-ство рецепторов, но не их число, а уменьшение связывания простагландина зависит от дозы и времени воздействия TPA (Kawase et al., 1991).

Другим способом снижения уровня cAMP опухолевыми промоторами мо-жет быть увеличение активности фосфодиэстеразы cAMP. Такие данные полу-чены, например, при воздействии форболовым эфиром на культивируемые клетки яичника китайского хомячка. Это воздействие приводило к сверхэкс-прессии α-изоформы PKC, увеличению активности фосфодиэстеразы cAMP уже через 1 ч после начала эксперимента, но, правда, быстро происходила и обрат-ная инактивация этого фермента (Spence et al., 1995). К падению содержания cAMP в стимулированных промоторами клетках причастны, очевидно, и сни-женные уровни окислительного фосфорилирования и синтеза ATP в митохон-дриях, характерные для определённых периодов митотического цикла (Лю, Ефимов, 1978). Падение же концентрации cAMP немедленно отражается на многочисленных cAMP-зависимых процессах в цитоплазме и ядре, участвую-щих в реализации пролиферации стимулированных клеток (см. рис. 16).

Активация гуанилатциклазы различными эфирами форбола коррелирует с их митогенной активностью и способностью стимулировать опухолевый рост. Ингибиторы LOX, подавляя окисление арахидоновой кислоты, предупреждают стимуляцию промотором мембранной гуанилатциклазы. В одной из работ (Sni-der et al., 1984) был предложен механизм стимуляции гуанилатциклазы различ-ными агонистами, согласно которому возбуждаемый рецептор активирует PLC, гидролизующую PIs; PLA₂ освобождает из продуктов их гидролиза арахидонат, последний же окисляется LOX, а продукты его окисления активируют гуани-латциклазу. При этом мобилизиуемый IP₃ свободный Са²⁺ стимулирует синтез cGMP, поскольку является активатором PLA₂. К настоящему времени такое представление в основном считается доказанным. Правда, существует ещё предположение об изменении уровня cGMP самой PKC путём модификации гуанилатциклазы, как вероятного субстрата PKC (Иващенко, Быкорез, 1990).

Таким образом, активация гуанилатциклазы и повышение уровня cGMP в стимулированной клетке в конечном счёте сопряжены с функционированием PPI-цикла, участвующего в передаче сигнала (Кухарь и др., 1991). В целом же, приведённые выше сведения о циклических нуклеотидах соответствуют мне-нию большинства исследователей о том, что снижение содержания cAMP и повышение уровня cGMP в клетке относятся к наиболее ранним изменениям, развивающимся после начала воздействия ростстимулирующего фактора.

Митогенные и опухолепромоторные факторы путём изменения концентра-ции циклических нуклеотидов управляют интенсивностью многих внутрикле-точных процессов, в том числе энергетических. В этой связи напомним, что митохондриальное дыхание активируется cAMP, а гликолиз подавляется им; при уменьшении содержания cAMP в клетке дыхание ослабляется, гликолиз же усиливается (см. п. 2.1.12). Действительно, TPA, снижающий внутриклеточный уровень cAMP (см. выше), увеличивает поглощение глюкозы и скорость глико-лиза в нормальных клетках. Например, в куриных эмбриональных фиброблас-тах TPA повышает концентрацию фруктозо-2-6-дифосфата – основного физио-логического активатора фермента гликолиза фосфофруктокиназы и соответст-венно скорость гликолиза. Другие промоторы химического канцерогенеза и эндогенные активаторы PKC (DAGs) также стимулируют гликолиз, повышая уровень фруктозо-2-6-дифосфата и поглощение глюкозы клетками (Bosca et al., 1985). Интенсифицируя гликолиз, TPA стимулирует синтез молочной кислоты, что ведёт к снижению рН среды. С другой стороны, форболовые эфиры и DAG, напротив, могут и повышать цитоплазматический рН. Этот феномен связыва-ется со способностью активированного PKC в норме стимулировать Na⁺/H⁺-обмен и, несмотря на усиление образования молочной кислоты, повышать тем самым значение внутриклеточного рН (см. п. 3.4.1).

Опухолевые промоторы из класса форболовых эфиров вызывают в клетках дезорганизацию микрофиламентов, которая усиливается при увеличении концентрации промотора или длительности инкубации с ним, а при снижении концентрации уменьшается количество клеток, чувствительных к действию этих промоторов (Rahilly, Eleming, 1992 и др.). Интересны также данные Лясса (1988) об изменении сократительных свойств цитоскелета фибробластов под действием опухолевых промоторов. TPA, в частности, подавляет актомиози-новую сократимость клеток, причём для проявления этого эффекта необходима сохранность системы микротрубочек и промежуточных филаментов. Предпо-лагается, что торможение сокращения реализуется путём фосфорилирования PKC цитоскелетных белков, например, миозина, а обнаруженное действие TPA является одним из проявлений его способности обратимо усиливать экспрессию трансформированного фенотипа.

Существенно, что TPA и некоторые другие эфиры форбола стимулируют фосфорилирование ферментом PKC винкулина – одного из белков, прикреп-лённых к фокальному контакту. Следовательно, винкулин, известный как объ-ект фосфорилирования онкобелком src, служит также физиологическим субст-ратом для PKC, хотя фосфорилированию этими ферментами подвергаются разные участки молекул винкулина. В культуре эмбриональных фибробластов крысы присутствуют два пула PKC типа 3 (PKC-3), один из которых диффузно распределён по цитоплазме, а второй – ассоциирован с цитоскелетом. После удаления цитозольной PKC-3 распределение этого изофермента в остающихся препаратах цитоскелета соответствовало распределению белков фокальных контактов винкулина и талина. Активация же PKC-3 PMA сопровождалась деполимеризацией микрофиламентов. Эти факты показывают, что PKC-3 может быть модуляторным компонентом фокальных контактов и способна нарушать ассоциацию микрофиламентов с плазматической мембраной (Jaken et al., 1989).

С дестабилизацией элементов цитоскелета связаны изменения и поверхно-стных структур клетки, участвующих в адгезионных и межклеточных взаимо-действиях. Так, при воздействии TPA на культуру эмбриональных клеток сирийского хомячка уменьшается число контактирующих клеток (Ruch et al., 1990). В последующем факты ослабления опухолевыми промоторами меж-клеточных связей в различных клеточных системах и уменьшения числа кон-тактных зон подтверждались неоднократно (Rahilly, Eleming, 1992 и др.). Напомним, что рассмотренные здесь вопросы поднимались нами и в п. 2.4 в связи с обсуждением роли пероксидации и нарушений интегративных межкле-точных контактов в инвазивном росте и метастазировании неоплазм.

Одно из основных проявлений действия опухолевых промоторов состоит в индукции активности ODC – фермента, как отмечалось уже в п. 2.3.3, необ-ходимого для синтеза полиаминов и пролиферации клеток (Pegg et al., 1995). Все промоторы стимулируют ODC, но не все вещества, индуцирующие этот фермент – промоторы. Это положение подтверждено множеством фактов. Про-цессы индукции ODC и стимуляции роста опухолей их промоторами протека-ют с участием активированного О₂ и (или) свободных радикалов. Активность ODC повышают и органические перекиси. Способности же антиоксидантов по-давлять индуцированные LOX процессы окисления и стимулированную TPA активность ODC коррелируют. Индукцию ODC и пролиферацию, вызванные TPA, подавляют также ингибиторы LOX (Nakadate, 1989) и гепарин (Pintus et al., 1998). TPA индуцирует в клетках (фибробластах) поли(ADP)-рибозилиро-вание ядерных белков, играющего, вероятно, важную роль в опухолевой транс-формации и в регуляции экспрессии генов. Увеличение поли(ADP)-рибозили-рования указанных белков вызывают также PMA и супероксид (Cerutti, 1986).

Индуцируя прооксидантный статус, опухолевые промоторы стимулируют и синтез ДНК, который соответствует относительно высокой активности PKC (Arita et al., 1992). Избыточный же уровень пероксигенации может приводить к генотоксическим изменениям, особенно в тех случаях, когда содержание АФК и продуктов ПОЛ ещё более возрастает за счёт продуцируемых фагоцитами. Последние, кстати, тоже могут быть объектом поражения «собственными» АФК. Например, гранулоциты (макрофаги) после обработки форболовыми эфи-рами повышают образование АФК (О ), которые увеличивают число разрывов в ДНК, в основном однонитевых. Правда, точная корреляция между количест-вом О и числом разрывов в ДНК здесь отсутствует (Birnboim, Sandhu, 1997). Результатом выделения АФК при действии промоторов может быть модуляция активности генов, в частности, изменение экспрессии клеточных протоонко-генов. Одним из примеров такого рода служит индукция форболовым эфиром протоонкогена c-fos в Т-клетках человека (линия Jurkat). Тиоловые антиокси-данты подавляли экспрессию указанного онкогена, и в этой связи обсуждается участие реактивных форм О₂ в регуляции экспрессии c-fos, индуцированной эфиром форбола (Mizuno, Packer, 1994). Вообще же, причастность АФК к экспрессии различных генов, в том числе протоонкогенов, показана в ряде авторитетных работ последних лет (см. п. 1.1.1).

При нормальном митогенезе, индуцируемом стимуляторами роста, часть процессов в ядре протекает с участием одной или нескольких транслоцирую-щихся в неё изоформ PKC. Так, при изучении действия TPA на клетки NIH 3T3 обнаружили, что он значительно увеличивает количество PKC-3, ассоцииро-ванной с ядерными компонентами. В контрольных клетках PKC-3 диффузно распределена по цитоплазме, часть изофермента ассоциирована с цитоскелетом, а ядра оставались неокрашенными; обработка же клеток PMA приводила к перераспределению PKC-3 и накоплению в ядерной мембране (Leach et al., 1989). Тот же форболовый эфир заставлял большинство PKC-α, -δ и –ε, вначале находившихся в цитозоле эпителиальных клеток WB печени крыс, транспор-тироваться в мембранную или ядерную фракцию (Maloney et al., 1998). Ядерная PKC дозозависимо фосфорилировала серинсодержащие участки ламинов ядер-ной оболочки, при этом активация фосфорилирования и митогенный эффект были взаимосвязаны (Fields et al., 1990). Возможными объектами фосфорили-рования в ядре назывались ДНК-полимераза α, ДНК-топоизомераза II и др. Таким образом, стимулирование пролиферации закономерно связывается с транслокацией различных изоформ PKC из цитоплазмы как в плазматическую мембрану, так и в ядерные структуры.

Неожиданное обнаружение в ядре изоформы PLC-β₁ чуть проясняет здесь ситуацию. Предположительно, эта изоформа PLC может (через образование DAG) индуцировать транслокацию в ядро специфического изозима PLC. Более того, показаны синтез и гидролиз фосфорилированных форм PI в ядре, сущес-твование нескольких типов автономных внутриядерных циклов инозитида. Эти циклы рассматриваются как центральное промежуточное звено в передаче сигнала, причём PLC-β₁ может считаться ключевым ферментом, стимуляция или ингибирование которого, по-видимому, необходимы для осуществления митоген-активируемого клеточного роста или дифференцировки (Manzoli et al., 1996). Интересно также, что обнаруженный ранее в ядерной мембране липидо-подобный активатор, оказавшийся фосфатидилглицерином, назван физиологи-ческим регулятором ядерной PKC, в частности изоформы PLC-βII (Murray, Fields, 1998).

3.1.3. Несколько иное положение с промоторо- и PKC-зависимыми эффек-тами складывается в уже трансформированных и опухолевых клетках, где, по данным большинства исследований, активность фосфолипидозависимой PKC обычно снижена. Например, в биопсиях из аденом и злокачественных опухолей кишечника человека общая активность PKC и активность мембраносвязанной PKC были в 2-3 раза ниже, чем в неизменённой слизистой. Кроме того, свя-зывание промотора (форбол-12,13-дибутирата) выше в нормальных клетках по сравнению с трансформированными (Kopp et al., 1991). В случае рака толстой кишки снижение активности PKC не зависело от гистологического типа и локализации опухоли, но коррелировало с её величиной (Kusunoki et al., 1992).

Устойчивое снижение активности PKC в клетках неоплазмы имеет, на наш взгляд, прямое отношение к возникновению и поддержанию характерных для них свойств и признаков, проявляющихся в связи со специфически выраженной разрегулированностью многих внутриклеточных процессов. Например, в транс-формированных и опухолевых клетках дестабилизация примембранных микро-филаментов и цитоскелета в целом обеспечивается теперь в основном PKC-независимыми механизмами. Это мнение подтверждают данные о непрочно-сти связи с цитоскелетом и беспорядочном распределении PKC в эмбриональ-ных фибробластах, трансформированных вирусом SV-40. В нормальных же фибробластах PKC связана с цитоскелетом прочнее, причём она концентриру-ется в фокальных контактах. Указанное различие в субклеточной локализации PKC коррелировало с потерей двух PKC-связывающих белков в трансформи-рованных клетках (Hyatt et al., 1990).

В норме действует, по-видимому, PKC-зависимая обратимая реорганизация цитоскелета, управляющая изменением формы и подвижности клеток (Василь-ев, Гельфанд, 1988), в частности, процессом разъякоривания рецепторов, белков фокальных контактов, компонентов внеклеточного матрикса от плазматической мембраны и тем самым уже причастная к клеточной пролиферации. Однако в опухолевых и трансформированных клетках эта система регуляции оказывается дезорганизованной ввиду, как уже отмечалось, постоянной инактивации значи-тельной части фосфолипидозависимых молекул PKC и (или) модификации ещё каких-то компонентов системы; нарушение целостности цитоскелета и связан-ные с ним характерные признаки трансформированного фенотипа определя-ются теперь иными, PKC-независимыми механизмами, в которых ключевую роль, скорее всего, играют состояние пероксидации и определённые клеточные онкобелки.

Другим вероятным следствием падения активности PKC при непрерывной и длительной промоции, но особенно в уже трансформированных и опухолевых клетках, является создание и поддержание в них кислой среды. Наряду с тем, что в указанных клетках повышены уровень гликолиза и продукция молочной кислоты, способствующие, несомненно, закислению среды, главной всё же причиной снижения рН представляется «выключение» PKC в условиях обра-зующейся внутриклеточной гипероксии и устойчивого ПОЛ. В итоге актива-ция Na⁺/H⁺-антипортера со стороны PKC существенно ослабляется или вовсе прекращается.

Справедливости ради следует отметить, что иногда, в противоположность сказанному выше, приводятся факты высокой активности PKC в некоторых типах опухолей, например, в клетках глиом человека (Baltuch, Yong V. W., 1996). Причины этого различия не совсем ясны. Можно предположить, что в подобных исследованиях анализу подвергаются преимущественно независимые от фосфолипидов изоформы PKC, которые при окислительном стрессе не инак-тивируются.

По некоторым данным (Wali et al., 1991), в опухоли содержание DAG более высокое, чем в нормальной ткани. С другой стороны, содержание PIs в опухо-лях разной локализации у онкобольных увеличено в 2,2 раза по сравнению с показателем для здоровой ткани (Слюсарь, Каргаполов, 1991). Указанные раз-личия требуют осмысления и выяснения того, являются ли они итогом сокраще-ния расходов DAG и инозитсодержащих фосфолипидов или же повышения скорости их образования. Наличие множества положительных и отрицательных обратных связей в системе метаболизма PIs весьма затрудняет такой анализ. Можно предположить, что существенную роль здесь играет фосфатидовая кис-лота, образующаяся из DAG. Она активирует PLC (Moolenaar et al., 1986), увеличивая тем самым уровень DAG за счёт гидролиза PPI, а часть фосфати-довой кислоты возвращается для синтеза PI.

Таким образом, снижение активности PKC происходит несмотря на увели-чение концентрации DAG, а интенсивное преобразование PI в PPI и ряд других PKC-зависимых процессов осуществляются теперь за счёт подключения ка-ких-то других механизмов. Подозрение падает, прежде всего, на цитоплаз-матические онкобелки-тирозинкиназы, способные при определённых условиях «работать» в непрерывном режиме. Таковыми могут считаться продукты про-тоонкогенов src, ros, а также mil и raf (см. п.3.4.2). Участвуя в фосфорили-ровании PI и его производных, они увеличивают содержание в мембране как раз той формы фосфатидилинозитдифосфата (PIP₂), которая расщепляется PLC. «В конечном счёте это приводит к активизации образования DAG и IP₃ по неконтролируемому пути, не зависящему от факторов роста и других стимуля-торов пролиферации» (Ивашкин и др., 1987). Повышение уровня метаболитов PIs и связанный с ним рост концентрации арахидоновой кислоты, должен интенсифицировать функцию сигнальных LOX- и COX-путей с синтезом био-логически активных соединений, причастных к процессу пролиферации.

Рассмотренные пути метаболизма фосфолипидов в стимуляции пролифера-ции приводят к образованию АФК и продуктов ПОЛ, активирующих фосфоли-пазы, в том числе PLA₂ (Byczkowski, Channel, 1996; Sakamoto et al., 1999). В результате возникают ещё замкнутые циклы с положительной обратной связью по поддержанию увеличенных концентраций DAG, IP₃ и Ca²⁺. Возможные ме-ханизмы некоторых входящих в указанный комплекс процессов обсуждаются нами в п. 3.2. Вместе с тем, чтобы избежать последствия цитотоксичности избыточных уровней АФК и ПОЛ, природа должна была предусмотреть в определённых случаях какие-то ограничительные меры. Одной из них, вероя-тно, является отрицательная обратная связь: инактивация 12-LOX различными радикалами, особенно О и ОН˙, показанная в гомогенате эпителиальных кле-ток. Чувствительность этого фермента к действию АФК подтверждена тем, что количество образующейся в его присутствии 12-гидроксиэйкозатетраеновой кислоты из арахидоновой значительно увеличивается, если добавить в гомо-генат каталазу или SOD (Müller, Gawlik, 1997). Однако в другом случае на примере В-лимфоцитарных клеток BL41-E95-A показан противоположный эффект: в присутствии Н₂О₂ или ксантин-ксантиноксидазы, а также гранулоци-тов, генерирующих АФК, активность 5-LOX указанных клеток повышается. Активирующее действие гранулоцитов обусловлено образованием Н₂О₂ или гидропероксидов, т. е. здесь АФК участвует в позитивной регуляции актив-ности 5-LOX (Werz et al., 2000). Из сказанного следует, что действие АФК на различные LOXs отличается и оно, возможно, определяется какими-то особен-ностями того или иного типа клеток.

Таким образом, участие PUFAs в функционировании сигнальных путей митогенеза несомненно. Более того, суммированы сведения о стимулирующем влиянии PUFAs, в том числе арахидоновой кислоты, на экспрессию в клетках различных типов ранних генов, опосредующих клеточные реакции на митоген-ные стимулы (Sellmayer et al., 1997). Очевидно, к модуляции экспрессии указан-ных генов PUFAs непосредственно не причастны. Эту функцию выполняют их метаболиты и АФК, образующиеся в LOX- и COX-реакциях (Иванов и др., 1999) и способные прямо или через другие соединения взаимодействовать с соответствующими факторами транскрипции. Вовлечённость АФК и арахидо-новой кислоты в пролиферацию наглядно показана, в частности, на примере гладкомышечных клеток, стимулированных действием фенилэфрина на α₂-ад-ренорецепторы (Nishio, Watanabe, 1997).

Другую группу опухолевых промоторов, также действующих путём обра-зования АФК и стимуляции деления инициированных клеток, представляют индукторы суперсемейства цитохрома Р-450 (CYP). Со ссылкой на современ-ные публикации Кобляков (1998) в своём содержательном обзоре указывает на прямые доказательства причастности индукторов CYP к образованию АФК в микросомах и усилению в них ПОЛ. В свою очередь, АФК (окислительный стресс) оказывают митогенное и промоторное действия, активируют опосре-дованно транскрипционные факторы c-jun и NF-kB, нарушают межклеточные коммуникации. Все эти эффекты индукторов CYP могут реализоваться через общий механизм путём активации онкобелка c-src, который, предположи-тельно, является первичным объектом воздействия АФК. В связи с этим возможно существование неизвестного пока рецептора АФК, приводящего в действие продукт гена c-src.

В целом, учитывая достаточно широкий перечень субстратов фосфорили-рования PKC, изменение активности изоформ этого ключевого фермента в процессе длительной промоции и в опухолевых клетках должно непосред-ственно нарушать регуляцию и многих других клеточных функций. Названные выше эффекты составляют лишь малую часть такой дисрегуляции. Большин-ство же биохимических и регуляторных сдвигов, вызываемых действиями PKC по фосфорилированию GTP-связывающих белков, тирозинкиназ, PLs, CYP, фосфофруктокиназы, тропонина, топоизомеразы и многих других субстратов в цитоплазме и ядре, ещё предстоит осмыслить в рамках обсуждаемых нами кислородно-перекисных моделей опухолевой промоции и канцерогенеза.