6 курс / Клинические и лабораторные анализы / Лабораторная_диагностика_туберкулеза_Ерохин_В_В_ред_

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Заключительная часть (5 мин)

Подводя итог, обращается внимание слушателей на роль учреждений ПМСП в деле своевременного (раннего) выявления туберкулеза лабораторными методами, преемственности служб, обеспечения качества исследований.

Рекомендуемая литература

1.Малахов В.Н., Заикин В.В., Евгущенко Г.В., Пузанов В.А., Хайдукова И.Л. Оценка качества микроскопии с окраской по Цилю-Нельсену в 283 лабораториях России (по данным первого цикла ФСВОК). // Материалы VIII Всероссийского съезда эпидемиологов, микробиологов и паразитологов. – М., 2002. – Том 3. – С. 195.

2.Меньшиков В.В. Стандартизация в лабораторной медицине: предлагаемая программа работы // Клин. лаб. диагн. – 2000. – №5. – С. 50–53.

3.Национальное руководство ФТИЗИАТРИЯ. Под общей ред. М.И. Перельмана. – М.: ГЕОТАР-Медиа, 2007. – 512 с.

4.Пузанов В.А., Пунга В.В., Катулина Н.И. и соавт. Роль учреждений здравоохранения в верификации диагноза туберкулеза органов дыхания лабораторными методами. // Проблемы туберкулеза и болезней легких. – 2009. – №5. – С. 15–21.

5.Унифицированный метод микроскопического выявления кислотоустойчивых микобактерий: Руководство для клинико-ди- агностических лабораторий лечебно-профилактических учреждений / В.В.Ерохин, В.И.Голышевская, С.А.Попов, В.А.Пузанов, Г.В.Евгущенко, Э.В.Севастьянова, Л.П.Мартынова, О.А.Иртуганова. – М.–Тверь: Триада. – 2008. – 132с.1.

6.Laboratory services in tuberculosis control. Part I: Organization and management. – 1998. – 64 pp.

7.Laboratory services in tuberculosis control. Part II: Microscopy. – 1998. – 62 pp.

8.Popov S., Puzanov V., Sabgaida T., Antonova N. The reality of TB lab risks during the national TB program performance. Russian Federation. // Eur.Resp.J., – 2004. – Vol. 24. – Suppl. 48. – P. 1249. – 198s.

Материально-техническое обеспечение

Мультимедийная или проекционная демонстрационные системы, экран, лазерная указка; набор тематических слайдов.

МОДУЛЬ 3. Культуральные методы выявления и идентификации возбудителя туберкулеза и микобактериозов

Тема 3.1. «Правила сбора, транспортировки, обработки и хранения диагностических материалов»

Количество аудиторных часов – 1

Примерный план лекции

Основные вопросы, освещаемые в лекции:

•Виды диагностического материала для микробиологических исследований при туберкулезе. Диагностический материал при туберкулезе легких и внелегочной локализации. Асептически собранный материал. Материал, содержащий постороннюю микрофлору или собранный без соблюдения правил асептического сбора.

•Организация сбора материала и правила биологической безопасности. Требования к расходным материалам. Правила сбора мокроты.

•Правила хранения и транспортировки диагностического материала, содержащего биологические объекты III-ей группы патогенности.

•Требования к качеству диагностического материала, прием и регистрация материала.

•Подготовка реагентов для обработки диагностического материала.

•Обработка диагностического материала, деконтаминация и

концентрация образцов.

Цель – формирование у слушателей представления о важности качества клинических образцов и диагностической значимости различных видов материалов, правилах их сбора, обработки и транспортировки.

Вводная часть (5–10 мин)

В вводной части лекции, с учетом контингента слушателей, может быть дан краткий обзор особенностей туберкулезного процесса, его форм и локализаций, и связанные с этим виды диагностических материалов, используемые в диагностике туберкулеза. Дается представление о цели культуральной диагностики туберкулеза.

Основные правила этого раздела работ изложены в Приказе №109 от 21.03.2003 г. (Приложение №10,11). Задачей этого этапа лабораторных работ является достижение необходимого высокого

РАЗДЕЛ 1. Лекционные материалы

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

исследований в целом и достоверности культуральной диагностики МБТ.

Для обеспечения безопасности проводимых работ лаборатории должны иметь лицензию на проведение данных видов исследований, использовать адекватные средства индивидуальной защиты и соблюдать правила Госсанэпиднадзора РФ.

Основная часть (30 мин)

Виды и правила сбора диагностических материалов

При туберкулезе легких наиболее ценным и доступным диагностическим материалом является мокрота. В случае затруднения отделения пациентом мокроты ее можно индуцировать раздражающей ингаляцией, а также исследовать другие диагностические материалы из верхних дыхательных путей. Возможно исследовать также другие диагностические материалы: физиологические и патологические жидкости, ткани и др. Мокрота является наиболее опасным инфекционным материалом при туберкулезе. В условиях ЛПУ мокрота для анализа на туберкулез собирается в кабине для сбора мокроты под надзором медицинского работника. Экскреция МБ происходит нерегулярно, поэтому практикуется 3-кратный анализ мокроты.

Центрифугирование. Жидкий материал подлежит центрифугированию с последующей микроскопией осадка. Следует использовать центрифугу с антиаэрозольной защитой и силой центрифугирования 3000g. Мочу центрифугируют, используя метод накопления осадка. В дальнейшем исследуют осадок.

Гомогенизация. Плотный материал в условиях соблюдения стерильности измельчают и гомогенизируют в 0,5–1,0 мл изотонического раствора. Постепенно доводят объем изотонического раствора до 4–5 мл. Полученную массу отстаивают 1–2 мин. Затем надосадочную жидкость центрифугируют, готовят мазок.

Хранение и транспортировка диагностических материалов

Собранный диагностический материал должен централизованно и как можно быстрее доставляться в лабораторию. Сбор диагностических материалов следует синхронизировать с его доставкой. Флаконы до момента отправки хранятся в отведенном для этих целей холодильнике или специальном контейнере.

Консервация. Диагностический материал, подлежащий в дальнейшем культуральному исследованию, не должен сохраняться в холодильнике (4–8°С) более 48–72 часов без применения консервирующих средств. При использовании консервантов материал со-

храняется при комнатной температуре. Однако для снижения их токсичности в отношении микобактерий пробы рекомендуется сохранять в холодильнике при температуре от 4 до 8°С.

Транспортировка. Во время транспортировки диагностический материал должен предохраняться от воздействия прямых солнечных лучей и тепла, а также повторного замораживания, что способствует снижению жизнеспособности микобактерий. Для транспортировки материала следует пользоваться биксами или специальными транспортировочными ящиками (контейнерами). Мазки для микроскопического исследования транспортируются в специальных планшетах. Для предохранения от перекрестной контаминации они не должны соприкасаться друг с другом. Каждая проба материала должна быть промаркирована и иметь индивидуальное направление, а вся партия – заполненный сопроводительный лист. Во избежание инфицирования сопроводительного листа и бланков индивидуальных направлений желательно помещать их в чистый конверт или полиэтиленовый пакет и передавать непосредственно в руки водителю автотранспорта, а затем медицинскому работнику, принимающему материал. При поступлении материала, не отвечающего требованиям инфекционного контроля, а также при отсутствии направления или маркировки (этикетки) на флаконе с материалом он подлежит уничтожению с обязательным извещением об этом учреждения, направившего материал. Перечисленные вопросы находятся в компетенции руководителя лаборатории.

Партию культурального материала упаковывают согласно санитарным правилам (СП 1.2.036-95) Госкомсанэпиднадзора России. Транспортировочный контейнер маркируют знаком «Биологическая опасность». Для свободного перемещения необходимо оформить сопроводительное письмо на официальном бланке. Ор- ганизация-отправитель должна сообщить срочной связью получателю дату и вид транспорта, которым отправлена посылка. При необходимости для исключения всех видов досмотра и контроля оформляют справку по специальной форме вышеуказанных санитарных правил.

Принципы предпосевной обработки диагностического материала

Обычные микробиологические методики не могут быть использованы при проведении исследований на туберкулез. Это объясняется тем, что рост микобактерий туберкулеза происходит очень медленно (в течение 3–10 недель), а большинство проб клинического материала загрязнены быстрорастущими гноеродными и гни-

РАЗДЕЛ 1. Лекционные материалы

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

лостными микроорганизмами. Их бурный рост на богатых питательных средах мешает развитию микобактерий и не позволяет их выделение. Поэтому перед посевом диагностический материал обязательно подвергается так называемой предварительной обработке. Исключение составляет материал, полученный из закрытых полостей с соблюдением правил асептики (спинномозговая, плевральная, перикардиальная, синовиальная, асцитическая жидкости, кровь, пунктаты). Кроме того, микобактерии, выделяющиеся из дыхательных путей больного, как правило, окружены большим количеством слизи, затрудняющей их концентрирование. Таким образом, предварительная обработка материала перед посевом на питательные среды преследует две основные цели: максимально разжижить и гомогенизировать материал с целью концентрации микобактерий и «подавить» рост других микроорганизмов.

Все детергенты и деконтаминанты, применяемые в настоящее время для разжижения и деконтаминации клинического материала, обладают токсическим воздействием на микобактерии. Чтобы сохранить при обработке достаточную часть микобактериальной популяции, необходимо использовать щадящие методы обработки, позволяющие, с одной стороны, подавить быстрорастущие не специфические микроорганизмы, а с другой – максимально сохранить жизнеспособность микобактерий.

В зависимости от материала, степени его гомогенности и загрязненности для предпосевной обработки материала используют различные деконтаминанты: для мокроты – едкий натр, трехзамещенный фосфорнокислый натрий, бензалкониум хлорид тринатрий фосфата, NALC-NaOH (N-aцетил-L-цистеин-гидроксид натрия) с конечной концентрацией NaOH 1%; для мочи и других жидких материалов – растворы серной кислоты; для проб, загрязненных факторами внешней среды, жиросодержащих материалов

– раствор щавелевой кислоты (до 5%).

Заключительная часть (5 мин)

Подводя итог, обращается внимание слушателей, на основные принципы и правила сбора, транспортировки, обработки и хранения диагностических материалов. Необходимо подчеркнуть важность контроля за сбором и доставкой материалов – важным преаналитическим этапом. Следует также обратить внимание на меры инфекционного контроля при проведении перечисленных процедур, а также меры, исключающие кросс-контаминацию образцов во время их предварительной обработки.

Рекомендуемая литература

1.Пузанов В., Катулина Н., Гуськов П. и соавт. Факторы, определяющие эффективность верификации туберкулеза лабораторными методами в учреждениях общей лечебной сети // Материалы научной сессии, посвященной 85-летию ЦНИИТ РАМН «Актуальные проблемы туберкулеза и болезней легких». – 2006.

– С. 63–64.

2.Пузанов В., Полоцкий В., Кульпина Т. и соавт. Качество диагностического материала как маркер адекватности преаналитического этапа // Пульмонология. Сб.тезисов, 15й нац. конгресс по болезням органов дыхания. – 2005. – т. 689. – С. 189.

3.Санитарно-эпидемиологические правила «Безопасность работы с микроорганизмами III–IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней» (СП1.3.2322-08).

4.Федеральные санитарные правила, нормы и гигиенические нормативы «Порядок учета, хранения, передачи и транспорти-

рования микроорганизмов I–IV групп патогенности» (СП 1.2.036–1995).

5.Фтизиатрия. Национальное руководство. Под ред. М.И. Перельмана. – М., 2007.

6.Приказ МЗ РФ от 12.01.1999г. № 8 «О введении в действие Положения о порядке инспекционного контроля за деятельностью клинико-диагностических и экспертных лабораторий в здравоохранении».

7.Приказ МЗ РФ от 21.03.2003г. №109 «О совершенствовании противотуберкулезных мероприятий в Российской Федерации», Приложение 11.

8.Kent P.T., Kubica G.P. Public Health Mycobacteriology. A Guide for the Level III Laboratory. Centers for Disease Control. – 1985. – 207 pp.

9.Laboratory services in tuberculosis control. Part I: Organization and management. – 1998. – 64 pp.

10.Laboratory services in tuberculosis control. Part III: Culture. – 1998.

– 96 pp.

Материально-техническое обеспечение

Мультимедийная или проекционная демонстрационные системы, экран, лазерная указка; набор тематических слайдов.

РАЗДЕЛ 1. Лекционные материалы

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Тема 3.2. «Питательные среды: характеристики и правила приготовления»

Количество аудиторных часов – 1

Примерный план лекции

Основные вопросы, освещаемые в лекции:

•Виды питательных сред

•Характеристика ингредиентов сред

•Приготовление питательных сред для культивирования микобактерий разных видов.

•Корректировка свойств плотных питательных сред.

Цель – формирование у слушателей более детального представления об особенностях культивирования микобактерий, как туберкулезных видов, так и нетуберкулезных, способных вызывать микобактериозы.

Вводная часть (5–10 мин)

В вводной части лекции по усмотрению лектора, с учетом контингента слушателей, может быть проведен краткий обзор развития культуральной диагностики туберкулеза, связи методов предварительной обработки и некоторых характеристик питательных сред, важных для последующего культивирования микобактерий.

Для обеспечения безопасности проводимых работ лаборатории должны иметь лицензию на проведение данных видов исследований, использовать адекватные средства индивидуальной защиты и соблюдать правила Госсанэпиднадзора РФ.

Основная часть (30 мин)

Культуральные особенности микобактерий туберкулеза

Микобактерии способны синтезировать практически все необходимые вещества, однако при искусственном выращивании они предпочитают обогащенные питательные среды из веществ животного происхождения.

Кислотность среды, температура. Наиболее благоприятное значение кислотности питательных сред находится в пределах 7,0– 7,2, оптимальная температура – 35–37 °C.

Источники азота и углерода, микроэлементы. Уже в 1894 году Proskauer и Beck показали, что аспарагин необходим для хорошего роста микобактерий туберкулеза. Тогда же к факторам роста отнесли лейцин, тирозин, таурин, соли аммония, хлористый натрий и глицерин. Оптимальное содержание аспарагина – 1,2%. Такое содержание аминокислоты должно находиться в свободном состоянии, независимо от присутствия белков в питательной среде.

L-аспарагин контролирует синтез других аминокислот в M.tuberculosis. Установлено, что из смеси различных аминокислот (например, аспарагина и аланина или аспарагина и глютаминовой кислоты) использование аминокислот всегда начинается с аспарагина. Этот эффект получил название катаболической репрессии. Интересно отметить, что после запуска метаболического пути использования аспарагина в качестве источника азота, одновременно эта аминокислота начинает синтезироваться как необходимое структурное соединение для построения пептидных цепей. Установлено, что M.tuberculosis могут усваивать креатинин и креатин. Аммонийные соли, например, железо-аммонийный цитрат, также может служить источником азота. Однако желатиновые или пептоновые среды не могут служить основой для их выращивания.

Глицерин. Первые наблюдения о благоприятном влиянии глицерина относятся к 1887 году. Скорость роста микобактерий находится в прямой связи с содержанием глицерина в питательной среде. Дыхание и обмен веществ микобактерий ускоряется, если вместо глицерина используется моноацетилглицерин или диацетилглицерин.

Детергенты. Поверхностно активные вещества жирового происхождения, такие как Твин-80, содействуют увеличению роста клеточных колоний в глубине питательной среды. Кислотоустойчивость и характерная морфология клеток M.tuberculosis не изменяются с применением детергентов. Обнаруженная эффективность поверхностно активных веществ объясняется частично тем, что они предотвращают «склеивание» клеток и делают вследствие этого поверхность микобактерий доступнее для диффузного поступления питательных веществ.

Влияние плазмы крови, сыворотки крови или альбумина сыворотки крови. Коагулированная сыворотка крови, а также коагулированная плазма кролика может с успехом использоваться в качестве добавки к плотной основе питательной среды для ускорения культивирования микобактерий туберкулеза. Однако, плазма или сыворотка от человека подобного влияния, как правило, не оказывают. Добавление альбумина сыворотки крови крупного рогатого скота в концентрации 0,25%, фибринолизина, антифибринолизина и протромбина в среду Proskauer-Beck дают положительный эффект на рост микобактерий. Альбумин – признанное вещество, которое с полным правом называют фактором роста, однако его действие в большей степени связано с тем, что различные токсичные вещества жизнедеятельности клеток микобактерий связываются с альбумином и становятся, таким образом, безвредными

РАЗДЕЛ 1. Лекционные материалы

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

для микобактерий. В пользу этого говорит то, что отдельное применение альбумина сыворотки крови крупного рогатого скота не ведет к увеличению скорости потребления кислорода клетками

M.tuberculosis.

Аутолизат дрожжей. Использование аутолизата дрожжей в качестве добавки приводит к улучшению ростовых свойств питательной среды. Созданные на этом принципе питательные среды (т.н. плотные питательные среды Аникина-6, -9) на яичной основе способствуют увеличению скорости роста и лучшей высеваемости микобактерий по сравнению с такой средой, как Левенштейна-Йен- сена. Однако факторы, ответственные за это явление неизвестны.

Яйцо как питательная среда. В 1936 году Calmette A. Обнаружил, что M.tuberculosis могут инфицировать яйца и хорошо размножаться внутри них. Это открыло возможность использования яиц в качестве основы для культивирования микобактерий и выделения их из многих патологических материалов и внешней среды. Рецептура питательных сред на яичной основе постоянно совершенствуется, однако в качестве международного стандарта приняты коагулированные яичные среды Левенштейна-Йенсена, Ogawa. В нашей стране получила распространение плотная питательная среда Финн-2, отличающаяся сниженным значением рН до 6,8 и несколько измененным солевым и аминокислотным составом. Она оптимизирована для засева материала, обработанного щелочными детергентами, и имеет улучшенные ростовые свойства. Эти плотные среды обладают хорошей технологичностью и удобством в работе с культурами микобактерий. Питательные среды на основе яичного белка, желтка и мясного экстракта (с добавками глицерина) показывают лучшие ростовые свойства (питательная среда Круду), однако эти модифицированные среды общепринято использовать в качестве дополнительных к стандартным.

Липиды. В результате создания синтетических питательных сред было установлено, что микобактериям туберкулеза для начала роста желательно присутствие определенного количества солей пальмитиновой кислоты. Это, по-видимому, объясняет хорошие ростовые свойства яичных питательных сред и отсутствие таковых у пептонных и желатиновых сред.

Характеристика питательных сред

Для посева диагностического материала используют разнообразные питательные среды, среди которых можно выделить 3 основные группы: плотные питательные среды на яичной основе; плотные или полужидкие питательные среды на агаровой основе; жидкие синтетические и полусинтетические питательные среды.

Каждая из этих сред имеет свои преимущества и недостатки. Оптимальная среда для культивирования МБТ должна быть недорогой, простой в приготовлении, состоять из широко доступных компонентов. Кроме того, среда должна подавлять рост сопутствующей микрофлоры, обеспечивать хороший рост при засеве небольшого количества микобактерий и возможность предварительной дифференциации выросших колоний по морфологическим признакам. Яичные среды в наибольшей степени соответствуют вышеперечисленным требованиям при проведении посева из мокроты.

Преимущества яичных сред: экономичность и простота приготовления; могут храниться в холодильнике до 4 недель; хорошо поддерживают рост большинства штаммов микобактерий туберкулеза; позволяют проводить предварительную идентификацию микобактерий по морфологии колоний; малахитовый зеленый, входящий в состав сред, подавляет рост быстрорастущей неспецифической микрофлоры, уменьшая вероятность контаминации питательных сред.

Недостаток яичных сред: появление роста микобактерий в сроки от 2 до 12 недель и более. Для повышения результативности культурального исследования следует использовать одновременно 2–3 питательные среды разного состава. В РФ наиболее широкое распространение получил набор из сред Левенштейна–Йенсена и Финн-II.

Среда Левенштейна-Йенсена

Среда ЛЙ применяется во всем мире в качестве стандартной среды для первичного выделения возбудителя туберкулеза и определения его лекарственной чувствительности. В состав этой питательной среды входит глицерин, который способствует росту M.tuberculosis. Для культивирования M.bovis среду ЛевенштейнаЙенсена обогащают 0,5% пируватом натрия, исключив из солевого раствора глицерин. С этой целью в состав солевого раствора вместо глицерина добавляют 8,0 г пирувата натрия. Применение этой модификации среды рекомендуется в тех территориях, где возможно распространение M.bovis. Реактивы, технология приготовления и правила хранения среды ЛЙ подробно описаны в приказе МЗ РФ №109.

Среда Финн-II

Рекомендована в нашей стране как вторая стандартная среда для выделения микобактерий. Она отличается от среды Левен- штейна-Йенсена тем, что вместо L-аспарагина в ней используется глутамат натрия и подбор солей рассчитан таким образом, что конечная кислотность среды (рН=6,3–6,8) имеет более низкое значе-

РАЗДЕЛ 1. Лекционные материалы