6 курс / Клинические и лабораторные анализы / Лабораторная_диагностика_туберкулеза_Ерохин_В_В_ред_

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Кроме того, техники измерения должны быть простыми, экономичными и быстрыми.

Современные методы типирования НТМБ, базирующиеся на анализе ДНК, включают в себя:

1)Плазмидное типирование

2)Анализ полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ) хромосомной ДНК, генов рРНК или плазмидной ДНК;

3)Секвенирование спейсора рРНК;

4)Анализ больших фрагментов рестрикции (large-restriction- fragment, LRF).

По мнению некоторых исследователей, "золотым стандартом" для молекулярного типирования видов НТМБ является ген 16S рРНК. Этот ген присутствует как у быстро растущих, так и у медленно растущих микобактерий, что позволило определить филогенетическое родство между видами НТМБ.

Заключительная часть (5 мин)

Рост числа заболеваний, вызванных НТМБ, способствовал тому, что исследование генома возбудителей микобактериозов является интенсивно развивающимся направлением в науке. Секвенированы геномы многих штаммов НТМБ, имеющих клиническую значимость, у ряда штаммов описаны плазмиды и уникальные мобильные элементы, и полиморфизм по строению ряда генов. На данный момент изучение генома НТМБ носит скорее прикладной характер, направленный на выявление маркеров для идентификации видов. Фундаментальные вопросы, касающиеся генетики видов НТМБ, в настоящее время освещены мало и являются перспективным направлением для проведения научных изысканий.

Рекомендуемая литература

1.Литвинов В.И., Макарова М.В., Краснова М.А. «Нетуберкулезные микобактерии». – М.: МНПЦБТ. – 2008. – 256 с.

2.Falkinham J.O., III Epidemiology of Infection by Nontuberculous Mycobacteria // Clinical Microbiology Reviews. 1996. – Vol. 9 (2). – P. 177–215.

Материально-техническое обеспечение

Мультимедийная или проекционная демонстрационная системы, экран, лазерная указка; набор тематических слайдов.

МОДУЛЬ 8. Молекулярные методы в кластерном анализе микобактерий туберкулеза

Тема 8.1. «Мишени в геноме микобактерий, применяемые для кластерного анализа»

Количество аудиторных часов – 1

Примерный план лекции

Основные вопросы, освещаемые в лекции:

•Вставочные последовательности

•Повторяющиеся последовательности

•Спейсорные последовательности в DR-локусе

•Однонуклеотидные мутации

Вводная часть (5–10 мин)

Отличительной особенностью всех представителей МБТК является значительное сходство геномов, >99%. Основными источниками генетического разнообразия у микобактерий служат мобильные элементы, делеции, варьирующие множественные повторы ДНК, точечные мутации.

При выборе генетического маркера для изучения эпидемиологии туберкулеза важно, чтобы маркер был достаточно полиморфным, что позволит отличать штаммы, не связанные эпидемиологически, но при этом частота транспозиций должна быть относительно небольшой, чтобы подтвердить связи родственных штаммов.

Основная часть (30 мин)

На сегодняшний день для молекулярно-генетического типирования микобактерий разработано около десятка различных технологий, однако наибольше распространение получило типирование на основе трех генетических маркеров.

•вставочная последовательность IS6110

•прямые повторы (direct repeat – DR),

•точные тандемные повторы (exact tandem repeat – ETR)

Вставочная последовательность IS6110. Вставочные последовательности (insertion sequence – IS) – это маленькие мобильные генетические элементы, обычно размером меньше 2,5 т.п.о., которые широко представлены в геноме большинства бактерий.

Первый из широко используемых методов молекулярной идентификации штаммов M.tuberculosis учитывал именно повторяемость вставочных последовательностей IS6110.

РАЗДЕЛ 1. Лекционные материалы

учаются фундаментальные вопросы происхождения и эволюции микобактерий.

Как и при любом генотипировании, существуют ограничения для применения типирования по ПДРФ IS6110. Одно из них касается интерпретации полученных результатов в регионах с низким генетическим разнообразием M.tuberculosis. В этом случае сходные профили гибридизации могут быть результатом разных путей трансмиссии, что делает этот метод эпидемиологически неинформативным.

Второе ограничение касается малокопийных штаммов (менее 6 копий IS6110): наличие "горячих точек" встраивания IS6110 может приводить к тому, что сходные профили гибридизации могут независимо формироваться у неродственных штаммов, что будет выражаться в низкой степени полиморфизма, основанного на IS6110. Более того, большинство штаммов M.bovis, включая M. bovis BCG, содержат единственную копию IS6110.

Два других молекулярно-генетических подхода, используемых для типирования M.tuberculosis, основываются на амплификационных технологиях.

Типирование на основе определения структуры локуса прямых повторов (DR локуса). DR локус – единственный регион в хромосоме M.tuberculosis, содержащий множественные копии прямых повторов длиной 36 п.о., которые повторяются от 10 до 50 раз, каждый из которых отделен от следующего неповторяющейся вариабельной последовательностью – спейсорной ДНК, каждый спейсор содержит от 37 до 41 п.о. Расположение спейсоров в DR локусе постоянно, а полиморфизм возникает за счет утраты или вставки сегментов DR локуса. Во всех штаммах M.bovis BCG, M.bovis и большинстве штаммов M.tuberculosis копия IS6110 встраивается в специфический сайт в одном из повторов длиной 36 п.о.

Типирование по спейсорным олигонуклеотидам, или сполиготипирование, включает амплифицирование DR локуса с помощью ПЦР с меченными праймерами, направленными наружу от повторяющейся последовательности в 36 п.о., в результате чего амплифицируются вариабельные спейсоры и повторы, специфичные для данного штамма M.tuberculosis. Полученные меченые продукты ПЦР затем используются в качестве зондов на мембране, на которую нанесены ковалентно связанные олигонуклеотиды, соответствующие каждому из 43 вариабельных спейсорных последовательностей, представленных в штамме M.tuberculosis H37Rv и M.bovis BCG. Они располагаются на мембране слева направо в том

РАЗДЕЛ 1. Лекционные материалы

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

же порядке, в котором они располагаются в DR локусе в штаммах M.tuberculosis H37Rv и в M.bovis BCG. Дифференциация штаммов основывается на числе спейсоров, представленных в DR регионе.

Метод сполиготипирования обладает рядом достоинств. Вопервых, этот метод – наиболее простой в плане выполнения процедуры анализа, коммерческие стандартизированные системы позволяют легко и быстро анализировать одновременно большое число образцов. Во-вторых, для сполиготипирования достаточно небольших количеств ДНК M.tuberculosis (в качестве материала может использоваться как чистая культура микобактерий, так и любые биологические образцы – мокрота, промывные воды бронхов, биопсийный материал). В-третьих, на сегодняшний день существуют две крупные общедоступные информационные базы, включающие данные сполиготипирования нескольких тысяч штаммов M.tuberculosis, выделенных в разных регионах мира. Это позволяет проводить сравнение результатов типирования, полученных в разных лабораториях мира, используя единую номенклатуру.

Однако, полиморфизм по DR локусу не позволяет дифференцировать штаммы M.tuberculosis также хорошо, как по IS6110 (то есть штаммы с различным профилем ПДРФ IS6110 могут иметь одинаковый сполиготип). То есть полиморфизм по DR локусу позволяет распределять штаммы в более крупные группы, чем при анализе по IS6110, что было использовано для установления принадлежности штаммов к определенным географическим ареалам.

Методы, основанные на тандемных повторяющихся последовательностях

Методы, основанные на тандемных повторяющихся последовательностях или на тандемных повторяющихся минисателлитных локусах, получили значительное распространение, прежде всего в идентификации ДНК человека. Генотипирование основывается на числе повторов в каждом из множества тандемных повторяющихся локусов, каждый из которых является независимым. В геноме штамма M.tuberculosis H37Rv был выявлен 41 независимый локус, названных микобактериальными рассеянными повторяющимися единицами (MIRU), состоящий из множественных копий тандемных повторов, рассредоточенных по хромосоме M.tuberculosis.

Локусы точных тандемных повторов (ETR) состоят из RU, которые являются идентичными копиями друг друга. В результате исследования генома H37Rv для анализа вариабельного числа тандемных повторов (VNTR) первоначально были отобраны 5 различ-

ных ETR локусов (ETR-A, B, C, D и F). Эти ETR локусы амплифицируются с помощью ПЦР с праймерами, комплементарными последовательностям, фланкирующим каждый из ETR локусов. ПЦР проводится раздельно для каждого праймера, после чего размеры продуктов реакции анализируются электрофорезом в геле, и по размеру фрагмента оценивается число RU в каждом локусе. Размеры индивидуальных RU в 6 различных ETR колеблются от 53 до 79 п.о. Число RU в каждом из ETR для разных штаммов может варьировать от 1 до 7 на локус, в одном локусе число RU варьирует от 1 до 6. Данные VNTR можно представить в цифровом виде по числу RU в каждом локусе.

На этом же принципе основан MIRU-анализ, в котором исследуется более 12 тандемных повторяющихся локусов (включая ETR- D и ETR-F), которые также различаются по числу копий тандемных повторов (от 2 до 8) и по последовательностям, что дает в результате 1,6х106 возможных комбинаций. MIRU-VNTR-типи- рование по разрешающей способности превосходит сполиготипирование и лишь незначительно уступает по этому параметру анализу ПДРФ IS6110. На сегодняшний день комбинация из 12 MIRU-локусов, обозначаемых как MIRU 2, 4, 10, 16, 20, 23, 24, 26, 27, 31, 39 и 40, получила для MIRU-VNTR-типирования M.tuberculosis наибольшее распространение. К несомненным преимуществам данного метода типирования может быть отнесена простота и доступность, поскольку осуществление простой ПЦР-реакции и анализ её результатов методом агарозного гель-электрофореза в настоящее время является рутинной процедурой для любой молеку- лярно-генетической лаборатории. Цифровой формат данных (количество тандемных повторов в исследуемых локусах) позволяет легко сравнивать генотипические данные, полученные в разных лабораториях, а также осуществлять их кластерный анализ. Использование автоматических систем капиллярного электрофоретического анализа и праймеров, меченных флюоресцентными красителями, дает возможность одновременной амплификации нескольких локусов в мультиплексной ПЦР-реакции и оценки результатов без последующего этапа агарозного гель-электрофореза. Это позволяет проводить быстрый и высокопроизводительный анализ большого количества клинических образцов.

Анализ однонуклеотидного полиморфизма. Изучение генетического полиморфизма полных геномов M.tuberculosis H37Rv и CDC1551 на уровне нуклеотидов обеспечило исследователей маркерами для дифференциации клинических штаммов, а также для

РАЗДЕЛ 1. Лекционные материалы

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

изучения филогенетической взаимосвязи штаммов M.tuberculosis. Выявленные однонуклеотидные полиморфизмы (ОНП) разделяются на несинонимичные (нсОНП) и синонимичные (сОНП), в зависимости от того, ведет ли точечная мутация к изменениям в аминокислотной последовательности, и, соответственно, в белке, за генетический код которого отвечает эта последовательность. Оба этих вида ОНП используются для дифференциации штаммов M.tuberculosis, но имеют различное эволюционное значение.

Несинонимичные мутации приводят к замене аминокислот, что в ряде случаев может давать некое преимущество для выживания микроорганизма и являться объектом естественного отбора. В этом случае идентичные нсОНП у разных штаммов могут появляться независимо в ходе "гомоплазии", и они не обязательно указывают на общее происхождение. Наиболее полно в литературе описаны нсОНП, ответственные за устойчивость к противотуберкулезным препаратам.

Синонимичные однонуклеотидные замены – это такие мутации в структурных генах или генах «домашнего хозяйства», которые не изменяют аминокислотную последовательность и являются функционально нейтральными, в отличие от нсОНП, и, следовательно, могут являться маркерами происхождения, обеспечивая основу для изучения эволюционного родства среди микобактериальных штаммов.

Секвенирование геномов 4 штаммов микобактерий туберкулезного комплекса выявило более, чем 400 сОНП. сОНП могут применяться для генотипирования штаммов и построения филогенетических деревьев, демонстрирующих генетическое родство штаммов. В настоящее время метод тестирования сОНП не является рутинным при эпидемиолого-популяционных исследованиях, но с его удешевлением и при разработке доступных высокопроизводительных технологий этот метод может получить широкое распространение.

Развитие методов типирования по выше перечисленным генетическим маркерам легло в основу молекулярной эпидемиологии туберкулеза. Основным положением молекулярной эпидемиологии является то, что прямые потомки данного патогена являются, главным образом, генетически стабильными длительное время и географически дистанцированными. Молекулярно-эпидемиоло- гические исследования используются для описания, дифференциации и группировки на основе родства популяции клинических штаммов M.tuberculosis. Группировка штаммов в кластеры имеет в

своей основе, как правило, степень подобия, принятую данной группой исследователей. Штаммовый кластер описывается как группа штаммов, которая имеет общие специфические биомаркеры или свойства, свидетельствующие о наличии общего недавнего предка.

Как правило, в популяционных исследованиях или исследованиях вспышек туберкулеза идентифицируется какой-либо преобладающий штамм, распространяющийся от человека к человеку, то есть происходит клональное распространение. Клональное распространение, в конечном счете, дает начало штаммовым вариантам, которые выявляются на основе их тонких генетических отличий от исходного штамма. Набор близкородственных штаммов, произошедших от общего предка, классифицируется как группа штаммов. Через некоторое время прогенные потомки микобактерий, формирующих группу штаммов, могут в последующем распространяться в популяции (клональная экспансия), давая начало вторичной группе родственных штаммов.

Заключительная часть (5 мин)

Благодаря развитию молекулярной биологии стало возможно изучение генома микобактерий туберкулезного комплекса. В результате была показана высокая консервативность структурных генов, и то, что вариабельность между штаммами обуславливалась вставочными последовательностями, содержанием повторяющихся элементов, геномными делециями и однонуклеотидными полиморфизмами.

Основными методами, применяющимися сегодня в молекулярной эпидемиологии, являются ПДРФ IS6110, сполиготипирование и MIRU-VNTR.

Каждый из этих методов имеет свои особенности и выбор применения метода диктуется конкретной задачей проводимого исследования и возможностями лаборатории.

Рекомендуемая литература

1.Черноусова Л.Н., Карачунский М.А. Молекулярная эпидемиология туберкулеза // Проблемы туберкулеза. – 2007. – № 4. – С. 3–7.

2.Bifani P. J., Shopsin B., Alcabes P., Mathema B., Kreiswirth B.N., Liu Z., Driscoll J., Frothingham R., Musser J.M. Molecular epidemiology and tuberculosis control // J.A.M.A. – 2000. – Vol. 284. – P. 305–307.

РАЗДЕЛ 1. Лекционные материалы

10.Sreevatsan S., Pan X., Stockbauer K.E., Connell N.D., Kreiswirth B.N., Whittam T.S., Musser J.M. Restricted structural gene polymorphism in the Mycobacterium tuberculosis complex indicates evolutionarily recent global dissemination // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 1997. – Vol. 94. – P. 9869–9874.

11.Supply P., Allix C., Lesjean S., Cardoso-Oelemann M., RuschGerdes, S., Willery E., Savine E., de Haas P., van Deutekom H., Roring S., Bifani P., Kurepina N., Kreiswirth B., Sola C., Rastogi N., Vatin V., Gutierrez M. C., Fauville M., Niemann S., Skuce R., Kremer K., Locht C., D. van Soolingen. Proposal for Standardization of Optimized Mycobacterial Interspersed Repetitive Unit-Variable- Number Tandem Repeat Typing of Mycobacterium tuberculosis// J. Clin. Microbiol. – 2006. – Vol. 44. – P. 4498–4510.

12.Supply P., Mazars E., Lesjean S., Vincent V., Gicquel B., Locht C. Variable human minisatellite–like regions in the Mycobacterium tuberculosis genome // Mol. Microbiol. – 2000. – Vol. 36. – P. 762–771.

13.van Embden J.D., Cave M.D., Crawford J.T., Dale J.W., Eisenach K.D., Gicquel B., Hermans P., Martin C., McAdam R., Shinnick T.M. Strain identification of Mycobacterium tuberculosis by DNA fingerprinting: recommendations for a standardized methodology // J. Clin. Microbiol. – 1993. – Vol. 31(2). – P. 406–409.

14.van Embden J.D.A, van Gorkom T., Kremer K., Jansen R., van Der Zeijst B.A., Schouls L.M. Genetic variation and evolutionary origin of the direct repeat locus of Mycobacterium tuberculosis complex bacteria // J. Bacteriol. – 2000. – Vol. 182. – P. 2393–2401.

15.van Soolingen D., Hermans P.W., de Haas P.E., Soll D.R., van Embden J.D. Occurrence and stability of insertion sequences in Mycobacterium tuberculosis complex strains: evaluation of an insertion sequence–dependent DNA polymorphism as a tool in the epidemiology of tuberculosis // J. Clin. Microbiol. – 1991. – Vol. 29. – P. 2578–2586.

16.Yeh R.W., Ponce de Leon A., Agasino C.B., Hahn J.A., Daley C.L., Hopewell P.C., Small P.M. Stability of Mycobacterium tuberculosis DNA genotypes // J. Infect. Dis. – 1998. – Vol. 177. – P. 1107–1111.

Материально-техническое обеспечение

Мультимедийная или проекционная демонстрационная системы, экран, лазерная указка; набор тематических слайдов.

РАЗДЕЛ 1. Лекционные материалы