6 курс / Клинические и лабораторные анализы / Лабораторная_диагностика_туберкулеза_Ерохин_В_В_ред_

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Основная часть (30 мин)

Сравнение результатов ПЦР-диагностики с традиционными методами выявления микобактерий

1.Время проведения анализа. ПЦР, как и бактериоскопия, требуют минимального времени проведения анализа, результат можно получить в день сдачи материала. Самым длительным методом является посев на плотные питательные среды (до 10 недель)

2.Чувствительность. ПЦР превосходит по чувствительности все классические методы. Может давать положительный результат, если в образце находится несколько микобактериальных клеток.

3.Специфичность. Специфичность ПЦР наиболее высокая из всех применяемых методов – 99,8%.

4.Стоимость. В стоимость включены только расходы на материалы и реагенты. Необходимо помнить, что в стоимость анализа также входит и время, затраченное на его проведение, таким образом, самым дорогим методом является посев.

5.Автоматическая интерпретация результатов. Снижает возможность ошибки, т.к. исключает субъективную оценку результатов.

6.Безопасность работы персонала. Самыми опасным являются культуральные методы.

Место ПЦР-анализа в лабораторной диагностике туберкулеза

ПЦР – быстрый и дешевый метод, позволяющий в течение нескольких часов вывить ДНК возбудителя в любом диагностическом материале. Поэтому метод необходимо широко использовать в клинических лабораториях фтизиатрического профиля.

Развернутые ПЦР-лаборатории, занимающиеся выявлением ДНК МБТ, определением лекарственной чувствительности, а также идентификацией микобактерий до вида, должны действовать на базе Центральных НИИ туберкулеза и НИИ фтизиопульмонологии, региональных и межрегиональных лабораторий.

В лабораториях ОЛС, проводящих микроскопию с окраской по Ziehl-Neelsen, а также в небольших городских и районных противотуберкулезных лабораториях, которые не могут позволить себе иметь развернутую ПЦР-лабораторию, приветствуется внедрение закрытых ПЦР-систем, например, картриджной технологии.

Категории пациентов, для которых целесообразно проводить ПЦР исследование?

1.Все впервые выявленные больные

2.Дифференциально-диагностические больные

3.После отрыва от лечения

4.Больные с подозрением на саркоидоз

5.Дети и подростки

6.Контакты

Спорные вопросы:

–Использование ПЦР для контроля химиотерапии. Несмотря на то, что существует много работ, доказывающих пользу применения ПЦР для контроля химиотерапии, многие исследователи сомневаются в целесообразности использования молекулярно-гене- тических методов для этой цели. По результатам ПЦР абациллирование у больных в среднем наступает позже, чем по результатам микроскопии и посева. Это объясняется более высокой чувствительностью ПЦР по сравнению с традиционными методами выявления МБТ. Возникает вопрос – надо ли считать больного, у которого посев и микроскопия отрицательны, а ПЦР положительна, бактериовыделителем? Выделяет ли он МБТ в достаточном количестве, чтобы быть опасным для окружающих? Все эти вопросы требуют решения.

–Использование ПЦР вместо микроскопии. Все сильнее укрепляющаяся «репутация» ПЦР как дешевого метода, сравнимого с микроскопией по скорости выполнения, но гораздо более превосходящего микроскопию по чувствительности и специфичности, заставило многих исследователей задуматься о замене микроскопии на ПЦР. Вопрос в настоящее время бурно обсуждается.

Заключительная часть (5 мин)

Заключительную часть рекомендуется посвятить ответам на вопросы

Рекомендуемая литература

1.Приказ МЗ РФ №109 от 21.03.2003. «О совершенствовании противотуберкулезных мероприятий в Российской Федерации»

2.Susceptibility testing of Mycobacteria, Nocardiae and other aerobic Actinomycetes; Approved Standards. – M 24–A. – Vol. 23. – №18.

3.Ngamlert K., Sinthuwattanawibool C., McCarthy K.D., Sohn H., Starks A., Kanjanamongkolsiri P., Anek-vorapong R., Tasaneeyapan T., Monkongdee P., Diem L., Varma J.K. Diagnostic performance and costs of Capilia TB for Mycobacterium tuberculosis complex identification from broth-based culture in Bangkok, Thailand // Trop Med Int Health. – 2009. – Vol. 14(7). – P. 748–753.

Материально-техническое обеспечение

Мультимедийная или проекционная демонстрационная системы, экран, лазерная указка; набор тематических слайдов.

РАЗДЕЛ 1. Лекционные материалы

Долгое время нетуберкулезные микобактерии считались сапрофитами. Сейчас известно, что многие из них (на слайде выделены красным) могут вызывать инфекционные процессы у человека и животных. Поэтому выявление НТМБ в диагностическом материале и идентификация НТМБ до вида является крайне актуальной проблемой фтизиатрии.

Основная часть (30 мин)

Основные методы идентификации НТМБ Традиционные бактериологические методы идентификации

НТМБ. Методы основываются на морфологии и функциональных особенностях клеток НТМБ.

Первичная идентификация проводится определением скорости роста культуры, цвета и вида колоний. Кислотоустойчивость и наличие/отсутствие корд-фактора выявляют с помощью окраски мазка по Ziehl-Neelsen. Также производят посев на плотные яичные среды, содержащие селективные препараты (гидразид тио- фен-2 карбоксиловая кислота, салицилат натрия, 5% NaCl, паранитробензойная кислота и т.д.). Помочь в идентификации может и определение оптимума роста на плотных средах при разных температурах, а также биохимические реакции: нитратредуктазный тест, тест на наличие термостабильной каталазы, тест на наличие пиразинамидазы и т.д.

В определителе бактерий Берджи для идентификации НТМБ описано множество тестов. Однако сложность состоит в том, что штаммы, относящиеся к одному и тому же виду НТМБ, могут давать разную реакцию на тесты (+/-). Время проведения традиционных бактериологических тестов велико, особенно в случае медленнорастущих видов НТМБ. Работа с культурой создает дополнительную опасность для персонала.

Всех этих недостатков лишены методы, основанные на ПЦР. Поэтому в настоящее время основными в дифференцировке НТМБ от M.tuberculosis complex должны быть именно молеку- лярно-генетические подходы.

Иммунохроматографический метод дифференцировки НТМБ от микобактерий туберкулезного комплекса. Основан на выявлении фракции белка MPT64, специфичного для микобактерий туберкулезного комплекса и не продуцирующегося НТМБ и посторонней флорой. Тест представляет собой стрип с иммобилизованными на ней антителами к MPT64. На полоску наносится культуральная среда. Результат проявляется в виде полоски

РАЗДЕЛ 1. Лекционные материалы

НТМБ. Ограничения: нельзя использовать диагностический материал, работа ведется только с выращенной культурой.

–ПЦР в режиме реального времени с праймерами, комплементарными специфическим для разных видов НТМБ участкам генома микобактерий. Достоинства: возможность выявления НТМБ непосредственно из диагностического материала.

Мишени в геноме микобактерий туберкулезного комплекса и НТМБ, использующиеся для дифференциации НТМБ от микобактерий туберкулезного комплекса

Геномы многих видов микобактерий, как НТМБ, так и туберкулезного комплекса расшифрованы. Поэтому производители наборов имеют практически неограниченный выбор участков-ми- шеней в геноме возбудителя туберкулеза и микобактериозов для конструирования праймеров, специфичных как для рода микобактерий в целом (для дифференциации микобактериальных штаммов от неспецифической флоры), так и для идентификации микобактерий до вида с помощью ПЦР.

Особой популярностью при создании ПЦР-систем для дифференциации микобактерий туберкулезного комплекса от НТМБ и неспецифической микрофлоры пользуется вставочная последовательность IS6110. IS6110 обнаружена только у микобактерий туберкулезного комплекса. Количество копий IS6110 в разных штаммов M.tuberculosis complex может варьировать от 1 до 25. Таким образом, чувствительность ПЦР возрастает, так как вместо одной мишени для отжига праймеров в пробирке оказывается сразу несколько (в среднем 13–14 копий на геном)

Также для дифференциального анализа M.tuberculosis complex от НТМБ используют ген hsp65. Он кодирует белок теплового шока весом 65 кДа. Белки теплового шока были найдены в клетках любых организмов. Экспрессия этих белков повышается, если клетка попадает в стрессовые условия, например, при повышении температуры. Играют защитную роль – стабилизируют работу других белков. Последовательность нуклеотидов, кодирующих белки теплового шока, имеет участки, специфичные для каждого вида микроорганизмов

Для идентификации до вида нетуберкулезных микобактерий методом ПЦР также используются следующие мишени:

Вставочная последовательность IS1245. Мобильный элемент генома, специфичный для M.avium. В геноме M.avium содержится несколько копий IS1245, что делает ПЦР более чувствительной.

РАЗДЕЛ 1. Лекционные материалы

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Этот мобильный элемент содержится также и в геноме подвида M. avium subsp. paratuberculosis.

Вставочная последовательность IS901. Мобильный элемент генома, специфичный для M.avium. Позволяет дифференцировать M.avium от подвидов.

Вставочная последовательность IS900. Является дифференцирующим маркером для M.avium subsp. paratuberculosis.

Регион, кодирующий 16S–23S рибосомальной РНК. Штаммы, принадлежащие к разным видам НТМБ, имеют в этом регионе генома специфические для своего вида участки. ПЦР с праймерами, комплементарными этим участкам детектирует до 30 видов НТМБ Ген hsp65. Этот ген, кодирующий белок теплового шока микобактерий, может с успехом использоваться как для выявления МБТ, так и для выявления НТМБ (членов MAC, M.chelonae, M.ab-

scessus)

Ген, кодирующий супероксиддисмутазу (SOD). Последовательность этого гена, содержащая вариабельные участки, специфические для разных видов НТМБ, позволили исследователям синтезировать праймеры, специфичные для M.avium, M.fortuitum,

M. gordonae, M.intracellulare, M.kansasii, M.scrofulaceum, M.simiae, M.xenopi

Заключительная часть (5 мин)

Проведение дифференциации M.tuberculosis complex от НТМБ и идентификация НТМБ до вида необходимо в любой клинической лаборатории, занимающейся выявлением больных туберкулезом и микобактериозами методом посева на плотные и жидкие питательные среды.

В заключении (на слайде) представлена схема алгоритма проведения идентификации положительной пробирки MGIT, культивированной в системе BACTEC MGIT 960. Среда для культивирования Middlebrook 7H9, использующаяся в системе BACTEC MGIT 960, не является селективной, хоть и содержит 4 антибиотика широкого спектра действия и 1 противогрибковый препарат для подавления роста посторонней флоры. Однако, полученную культуру перед постановкой теста на лекарственную чувствительность (ЛЧ) к противотуберкулезным препаратам (ПТП) необходимо идентифицировать, чтобы исключить наличие неспецифической флоры (грибов, бактерий) и выявить НТМБ.

На первом этапе предлагается провести либо иммунохроматографический тест, либо ПЦР на присутствие в пробирке M.tuber-

culosis complex. Параллельно с этими тестами культуральная среда засевается на кровяной агар для выявления неспецифической флоры. Результаты иммунохроматографического теста или ПЦР получают в тот же день, результаты посева на кровяной агар считывают через сутки.

Положительный иммунохроматографический тест (или ПЦР) и отсутствие роста на кровяном агаре означает, что в положительной пробирке MGIT выросла культура, принадлежащая к M.tuberculosis complex, и нет контаминации посторонней флорой. Такую пробирку можно использовать для проведения теста на ЛЧ.

Получение положительного иммунохроматографического теста (или ПЦР) и рост флоры на кровяном агаре означает, что в пробирке присутствует смесь M.tuberculosis complex и посторонней флоры, также нельзя исключить и наличие быстрорастущих НТМБ, способных дать рост на агаре за 24 часа. В этом случае следует либо запросить новую порцию диагностического материала от больного, а в случае, когда этого сделать невозможно, повторить предобработку для этого диагностического материала.

Отрицательный результат иммунохроматографического теста (или ПЦР) и рост флоры на кровяном агаре означает, что в положительной пробирке не содержится клеток, принадлежащих M.tuberculosis complex, однако есть либо неспецифическая микрофлора, либо быстрорастущие НТМБ, способные дать рост на агаре за 24 часа. Такую культуру необходимо исследовать более детально – провести первичную дифференциацию кислотоустойчивых НТМБ от посторонней микрофлоры микроскопией мазка с окраской по Ziehl-Neelsen. При выявлении кислотоустойчивых бактерий проводится определение до вида молекулярно-генетическими методами (наборы GenoTypeCM и GenoTypeAS или ПЦР со специфическими к видам НТМБ праймерами).

Отрицательный результат иммунохроматографического теста (или ПЦР) и отсутствие роста флоры на кровяном агаре означает, что в положительной пробирке не содержится клеток, принадлежащих M.tuberculosis complex и неспецифической микрофлоры, но возможно присутствие медленнорастущих и быстрорастущих НТМБ, неспособных дать рост на кровяном агаре за 24 часа. Такую культуру необходимо исследовать более детально – провести первичную дифференцировку кислотоустойчивых НТМБ от посторонней микрофлоры микроскопией мазка с окраской по ZiehlNeelsen, при выявлении кислотоустойчивых бактерий проводится определение до вида молекулярно-генетическими методами (на-

РАЗДЕЛ 1. Лекционные материалы

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

боры GenoTypeCM и GenoTypeAS или ПЦР со специфическими к видам НТМБ праймерами).

Рекомендуемая литература

1.Литвинов В.И., Макарова М.В., Краснова М.А. «Нетуберкулезные микобактерии». – М.: МНПЦБТ. – 2008. – 256 с.

2.Мороз А.М., Макарова М.В., Краснова М.А. Идентификация микобактерий методом высокоэффективной жидкостной хроматографии // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. – 2009. – № 3. – С. 64–66.

3.Мороз А.М., Макарова М.В., Краснова М.А. Сравнительные данные применения высокоэффективной жидкостной хроматографии для идентификации микобактерий, выделенных на жидкой и плотной питательных средах // Туберкулез и болезни легких. – 2009. – № 8. – С. 49–51.

4.Оттен Т.Ф., Васильев А.В. Микобактериоз. – СПб: Медицинская пресса. – 2005. – 224 с.

5.Приказ МЗ РФ №109 от 21.03.2003. «О совершенствовании противотуберкулезных мероприятий в Российской Федерации»

6.Хоулт Дж., Криг Н. Определитель бактерий Берджи. В 2-х т. Том 2. Изд. Мир, 1997. – 368 С.

7.Cook V.J., Turenne C.Y., Wolfe J., Pauls R., KabaniA. Conventional methods versus 16S ribosomal DNA sequencing for identification of Nontuberculous Mycobacteria: Cost Analysis // J. Clin. Microbiol. – 2003. – Vol. 41. – P. 1010–1015.

8.Kox L.F., van Leeuwen J., Knijper S., Jansen H.M., Kolk A.H. PCR assay based on DNA coding for 16S rRNA for detection and identification of mycobacteria in clinical samples // J. Clin. Microbiol. – 1995. – Vol. 33 (12) – P. 3225–3233.

9.Lee A.S., Jelfs P., Sintchenko V., Gilbert G.L. Identification of nontuberculous mycobacteria: utility of the GenoType Mycobacterium

CM/AS assay compared with HPLC and 16S rRNA gene sequencing. //J. Med. Microbiol. – 2009. – Vol. 58. – P. 900–904.

10.Mahillon J., Chandler M. Insertion Sequences // Microbiology and Molecular Biology Reviews. – 1998. – P. 725–774.

11.Park H., Jang H., Kim Ch., Chung B., Chang Ch.L., Park S.K., Song S. Detection and identification of Mycobacteria by amplification of the internal transcribed spacer regions with genusand species-spe- cific PCR primers // J. Clin. Microbiol. – 2000. – Vol. 38. – P. 4080– 4085.