6 курс / Клинические и лабораторные анализы / Лабораторная_диагностика_туберкулеза_Ерохин_В_В_ред_

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

ние и большую стабильность по сравнению со средой Левен- штейна-Йенсена. Эти свойства обусловливают более высокую эффективность среды при засеве материала, обработанного щелочными детергентами. Рост микобактерий появляется на этой среде на несколько дней раньше, чем на среде Левенштейна-Йенсена, а выделение культур на 6–8% выше. Реактивы, технология приготовления и правила хранения среды ЛЙ подробно описаны в приказе МЗ РФ №109.

Корректировка свойств плотных питательных сред

При приготовлении питательных сред следует учитывать влияния определенных ингредиентов питательных сред на рост некоторых видов микобактерий, а также влияния некоторых реагентов на параметры сред, такие как бактерицидность питательной среды, ее ростовые свойства. Контроль качества питательных сред предусматривает определение их стерильности, ростовых и физико-хи- мических свойств, таких как рН. Если заложенные параметры питательных сред выходят за предусмотренные рамки, то их корректируют составом питательных сред или корректировкой технологий приготовления.

Рекомендуемая литература

1.Приказ МЗ РФ от 21.03.2003г. №109 «О совершенствовании противотуберкулезных мероприятий в Российской Федерации», Приложение 11.

2.Фтизиатрия. Национальное руководство. Под ред. М.И. Перельмана. – М., 2007.

3.Kantor I.N., Kim S.J., Frieden T. et al. Laboratory Services in Tuberculosis Control. Parts I–II. – 1998. – Switzerland, Geneva, WHO.

4.Kent P.T., Kubica G.P. Public Health Mycobacteriology. A Guide for the Level III Laboratory. Centers for Disease Control, 1985. – 207 pp.

5.Laboratory services in tuberculosis control. Part I: Organization and management. – 1998. – 64 pp.

6.Laboratory services in tuberculosis control. Part III: Culture.– 1998.– 96 pp.

7.The Public Health Service National Tuberculosis Reference Laboratory and the National Laboratory Network. IUATLD, 1998, 110 pp.

Материально-техническое обеспечение

Мультимедийная или проекционная демонстрационные системы, экран, лазерная указка; набор тематических слайдов.

Тема 3.3. «Правила посева, культивирования, идентификации и интерпретации результатов»

Количество аудиторных часов – 1

Примерный план лекции

Основные вопросы, освещаемые в лекции:

•Посев и культивирование микобактерий туберкулеза и нетуберкулезных видов.

•Исключение кросс-контаминации при проведении культуральных исследований.

•Техника посева и инкубации. Алгоритм выборки посевов.

•Учет результатов посева диагностического материала.

•Первичная идентификация микобактерий на основе культуральных свойств. Группа Раньона.

•Дифференциация M.tuberculosis complex от нетуберкулезных микобактерий на основе биохимических свойств: реакции каталазной, нитрат-редуктазной активности.

•Видовая идентификация отдельных видов микобактерий туберкулезного комплекса.

Цель – формирование у слушателей представления об основ-

ных правилах культивирования микобактерий различных видов, учета результатов, возможностях культуральных и биохимических методов идентификации культур микобактерий. Знакомство с алгоритмом проведения исследований.

Вводная часть (5–10 мин)

Микобактерии имеют свои особенности культивирования. Дифференциация выделенных культур микобактерий имеет большое клинико-эпидемиологическое значение. Актуальность данной проблемы продиктована увеличением частоты выделения клинических штаммов нетуберкулезных микобактерий (НТМБ) от больных микобактериозами и от больных с сочетанной инфекцией.

В вводной части лекции по усмотрению лектора, с учетом контингента слушателей, может быть проведен краткий обзор развития биохимических и культуральных методов видовой идентификации микобактерий. Знакомство с алгоритмом идентификации микобактерий. Предварительная идентификация, видовая идентификация микобактерий, используемая в клинической практике.

РАЗДЕЛ 1. Лекционные материалы

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Основная часть (30 мин)

Правила посева, культивирования и интерпретации результатов

Правила посева диагностического материала

Достоверная клиническая интерпретация результатов микробиологического обследования достигается при обязательном соблюдении следующего правила: микроскопическое и культуральное исследования должны производиться параллельно только из одной и той же пробы диагностического материала.

Особенности культивирования микобактерий

Инкубация микобактерий туберкулеза имеет свои особенности. Они заключаются в том, что микобактерии размножаются чрезвычайно медленно – время деления микробной клетки составляет 18–24 часа. Это требует длительного срока инкубации для получения видимого роста колоний. Оптимальная температура инкубации – 37°С. При первичном посеве микроскопически отрицательного материала средняя продолжительность роста микобактерий туберкулеза на плотных питательных средах может составить 20–46 дней. Рост отдельных штаммов появляется через 60 и даже 90 дней. Это обусловливает необходимость при отсутствии роста микобактерий для выдачи отрицательного результата выдерживать посевы в термостате до 12 недель.

Инкубацию проводят в течение 12 недель при обязательном еженедельном просмотре; во время еженедельных просмотров регистрируют: “появление роста” – срок появления роста, начиная со дня посева и “интенсивность роста” – суммарное число колониеобразующих единиц (КОЕ) на всех пробирках.

Интерпретация результатов посева

При оценке результатов культурального исследования Появление роста КУМ в течение 7–10 дней культивирования на плотных средах может свидетельствовать либо о выделении быстрорастущих нетуберкулезных микобактерий, к которым комплекс M.tuberculosis не относится, либо о массивном обсеменении материала M.tuberculosis; такие культуры должны подвергнуться первичной идентификации.

•появление роста КУМ после 3–4 недель культивирования свидетельствует о выделении M.tuberculosis, а также других медленнорастущих микобактерий, которые могут относиться к потенциально патогенным нетуберкулезным МБ или к кислотоустойчивым сапрофитам;

• прежде, чем дать отрицательный ответ после 12 недель культивирования, необходимо убедиться в отсутствии роста очень медленнорастущих микобактерий, в числе которых могут быть и M.tuberculosis.

Во всех случаях получения роста во избежание неверного результата и загрязнения необходимо контролировать чистоту выросшей культуры с помощью микроскопии мазка по Ziehl-Neelsen.

Учет результатов посева диагностического материала При выделении культуры КУМ, отвечающих следующим ха-

рактеристикам: появление роста колоний на плотных питательных средах не ранее 3–4 недель инкубации; наличие колоний характерной морфологии и окраски; микроскопическое подтверждение кислотоустойчивости выделенного микроорганизма при окраске по Ziehl-Neelsen; следует произвести количественную оценку интенсивности роста.

Интенсивность роста обозначают по 3-х балльной системе:

Величина КОЕ (число колониеобразующих единиц) высчитывается как среднее по результатам подсчета числа колоний, выросших на всех пробирках. Все характеристики выросших на плотных питательных средах микобактерий заносятся в лабораторный журнал учета результатов культуральных исследований, в бланки ответов, а также в компьютерную базу данных полицевого учета.

Предварительная идентификация комплекса Mycobaterium tuberculosis

Первичная идентификация микобактерий комплекса M.tuberculosis от нетуберкулезных микобактерий осуществляется по культуральным характеристикам: скорость роста на плотных питательных средах; пигментообразование; морфология колоний; наличие кислотоустойчивости; температура роста.

Несмотря на то, что предварительное заключение о выделении МБТ может быть сделано на основании вышеперечисленных характерных признаков, подтверждение принадлежности выделенной культуры микобактерий к комплексу M.tuberculosis на основании специальных лабораторных тестов является обязательным.

Основные биохимические тесты идентификации M.tuberculosis.

Не существует какого-либо одного культурального иил биохимического метода, позволяющего достоверно отличить микобак-

РАЗДЕЛ 1. Лекционные материалы

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

терии комплекса M.tuberculosis от других МБ. Сочетание же вышеописанных признаков с результатами ряда приводимых ниже биохимических тестов позволяет провести идентификацию микобактерий комплекса M.tuberculosis с точностью до 95%.

Для дифференциации микобактерий комплекса M.tuberculosis от медленнорастущих НТМБ необходимо применять следующие основные биохимические тесты: тест на наличие способности продуцировать никотиновую кислоту (ниациновый тест); тест на наличие нитратредуктазной активности; тест на наличие термостабильной каталазы; тест на наличие роста на среде с натрием салициловокислым (1 мг/мл). В качестве дополнительных можно использовать: рост на среде, содержащей 500 мкг/мл паранитробензойной кислоты; рост на среде, содержащей 5% хлорида натрия. Для дифференциации M.tuberculosis и M.bovis следует учитывать результаты следующих проб: ниациновый тест; тест на наличие нитратредуктазы; тест на наличие пиразинамидазы; рост на среде, содержащей 2 мкг/мл гидразида тиофен-2 карбоксиловой кислоты (TCH).

Тесты для дифференциации отдельных видов микобактерий комплекса M.tuberculosis изложены более подробно в Приказе МЗ РФ №109 от 21.03.2003 (Приложение 11). Культурально-биохими- ческая характеристика микобактерий в соответствии с их делением по группам Раньона изложена в лекции 1.3. «Характеристика и таксономия микроорганизмов рода Mycobacterium».

Ниациновый тест. Ниацин-отрицательные штаммы M.tuberculosis встречаются чрезвычайно редко. Ниациновый тест не должен использоваться как единственный для идентификации M.tuberculosis, так как отдельные штаммы M.bovis, в том числе и субштаммы BCG, а также некоторые виды НТМБ (M.simiae, M.chelonae chemovar niacinogenes) обладают относительно высокой способностью синтезировать ниацин и давать положительную реакцию. Принцип метода. Ниациновая проба основана на том, что продуцируемая микобактериями никотиновая кислота, вступая в реакцию с цианистыми соединениями, дает ярко-желтое окрашивание. Наибольшее количество никотиновой кислоты обнаруживается у штаммов, выращенных на среде Левенштейна-Йенсена.

Тест на наличие нитратредуктазы. Реакция восстановления нитратов дает возможность дифференцировать микобактерии человеческого вида, обладающие нитратредуктазой, от микобактерий бычьего и птичьего видов и от некоторых нетуберкулезных микобактерий, у которых этот фермент отсутствует. Из всех МБ нитратредуктазная активность наиболее выражена у M.tuberculosis. Прин-

цип метода заключается в определении активности нитратредуктазы по количеству восстановленного нитрита из нитрата, что сопровождается цветной реакцией с парадиметиламинобензальдегидом.

Каталазный тест. Каталаза – это внутриклеточный растворимый фермент, который способен расщеплять перекись водорода на воду и кислород, т.е. обеспечивать следующую химическую реакцию: 2Н2О2 = 2Н2О + О2. При этом в реагирующей смеси образуются пузырьки кислорода, что указывает на наличие каталазной активности. Почти все виды МБ обладают каталазной активностью, за исключением M.bovis и некоторых резистентных к изониазиду штаммов M.tuberculosis.

Тест с салициловокислым натрием (салициловый тест). МБ комплекса M.tuberculosis не обладают способностью утилизировать салициловокислый натрий, который оказывает на рост МБТ угнетающее воздействие. Это свойство салицилата натрия используется как один из основных биохимических методов дифференциации M.tuberculosis и НТМБ.

Тест с паранитробензойной кислотой (PNB-тест). В лабораториях, в которых оборудование и/или отсутствие реагентов не позволяют производить постановку ниацинового и нитратредуктазного тестов, для идентификации МБТ может быть использована комбинация одного или нескольких описанных выше каталазных тестов, а также определение способности к росту при 37°С на среде Левенштейна-Йенсена, содержащей паранитробензойную кислоту (PNB-тест).

Тест с 5% хлоридом натрия. Тест используется для дифференциации МБ комплекса M.tuberculosis и выполняется аналогично тесту с паранитробензойной кислотой на среде Л-Й, содержащей 5% хлорида натрия. Метод основан на способности ряда видов НТМБ расти на среде, содержащей 5% хлорида натрия. МБ комплекса M.tuberculosis на этой среде не растут.

Пиразинамидазный тест. Тест применяется как дополнительный для дифференциации M.tuberculosis от M.bovis Тест основан на способности M.tuberculosis в течение 4-х дней дезаминировать пиразинамид до пиразиновой кислоты и аммония, что указывает на наличие пиразинамидазы. M.bovis не проявляет пиразинамидазной активности даже после 7 дней инкубации.

Тест с гидразидом тиофен-2-карбоксиловой кислоты (TCH). Тест используется для дифференциации M.bovis от M.tuberculosis и других медленнорастущих МБ. Только M.bovis чувствительны к низким концентрациям TCH (от 1 до 5 мкг/мл). M.tuberculosis и другие МБ обычно устойчивы к действию этого химического соединения.

РАЗДЕЛ 1. Лекционные материалы

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Совокупность характерных признаков микобактерий комплекса

M.tuberculosis: медленная скорость роста (более 3-х недель); температура роста в пределах 35–37°С; отсутствие пигментообразования (цвет слоновой кости); выраженная кислотоустойчивая окраска; положительный ниациновый тест; положительный нитратредуктазный тест; отсутствие термостабильной каталазы (68°С); рост в присутствии 1–5 мкг/мл ТСН; отсутствие роста на среде Л-Й, содержащей: 1000 мкг/мл натрия салициловокислого, 500 мкг/мл паранитробензойной кислоты, 5% хлорида натрия.

Для дальнейшей идентификации выросших культур микобактерий по группам Раньона используют материал лекции 1.3. «Характеристика и таксономия микроорганизмов рода Mycobacterium».

Иммунохроматографические методы идентификации

М.tuberculosis

M.simae, M.gastri, M.marinum, M.terrae имеют смешанный тип ферментативных реакций и обладают разной способностью роста на диагностических питательных средах. Эти микроорганизмы нечасто встречаются, однако они накладывают ограничения на точность культуральной диагностики.

В настоящее время появились разработки, посвященные выявлению антигенных белков, синтезируемых МБТ в процессе роста. Из 33 видоспецифических белков, белок MPT64 отличается тем, что он секретируется во внешнюю среду, являясь своеобразным индикатором роста клеток МБТ. Интенсивное накопление белка позволяет использовать его в тест-системах видовой идентификации МБТ с достаточно высокой диагностической чувствительностью. Примером может быть тест от Standard Diagnostics, Inc (Ю.Корея), разработанный для идентификации M.tuberculosis complex, выращенных на различных питательных средах. В тест-си- стеме используются мышиные моноклональные антитела к белку MPT64. Тестовое устройство включает стрип (полоску) из нитроцеллюлозной мембраны, на который нанесены в виде 2-х линий: тестовая полоса “T” (МРТ64) и контрольная полоса “C”.

Заключительная часть (5 мин)

Подводя итог, обращается внимание слушателей, на основные принципы культивирования микобактерий туберкулеза и нетуберкулезных видов. Важным моментом является контроль за характеристиками питательных сред и их коррекция. Одновременной использование нескольких сред с разными характеристиками и разной основой повышают результативность выделения микобактерий туберкулеза.

Современные ускоренные методы идентификации культур МБ имеет большое клиническое значение в современной микобактериологии. Они позволяют полностью использовать потенциал ускоренных методов культивирования и определения лекарственной чувствительности микобактерий туберкулеза. Проблема идентификации продиктована как увеличением частоты сочетанной заболеваемости ВИЧ-туберкулез, так и увеличением диагностической и аналитической чувствительности современных культуральных методов на автоматизированных системах.

Рекомендуемая литература

1.Вейсфеллер Ю.К. Биология и изменчивость микобактерий туберкулеза и атипичные микобактерии. – Изд. Академия Наук Венгрия. Будапешт. – 1975. – 335 с.

2.Литвинов В.И., Макарова М.В., Краснова М.А. Нетуберкулезные микобактерии. – М.: МНПЦБТ, 2008. – 256 с.

3.Оттен Т.Ф., Васильев А.В. Микобактериоз.– СПб: Медицинская пресса, 2005.–224 с.

4.Приказ МЗ РФ от 21.03.2003г. №109 «О совершенствовании противотуберкулезных мероприятий в Российской Федерации», Приложение 11.

5.Приказ МЗСР РФ от 2.10.2006г. № 690 «Об утверждении учетной документации по выявлению туберкулеза методом микроскопии».

6.Санитарно-эпидемиологические правила «Безопасность работы с микроорганизмами III–IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней» (СП1.3.2322-08).

7.Фтизиатрия. Национальное руководство. Под ред. М.И. Перельмана. – М., 2007.

8.Kent P.T., Kubica G.P. Public Health Mycobacteriology. A Guide for the Level III Laboratory. USA, Atlanta, Centers for Disease Control (CDC). – 1985 & 1995.

9.Laboratory services in tuberculosis control. Part III: Culture. – 1998.

– 96 pp.

10.Mykobacterien und mykobacterielle Krankheiten/G.Meissner. – Veb G.Fischer Verlag Jena. – 1980. – 377s.

11.The Public Health Service National Tuberculosis Reference Laboratory and the National Laboratory Network. IUATLD. – 1998. – 110 pp.

Материально-техническое обеспечение

Мультимедийная или проекционная демонстрационные системы, экран, лазерная указка; набор тематических слайдов.

РАЗДЕЛ 1. Лекционные материалы

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Модуль 4. Лекарственная чувствительность микобактерий и методы ее определения

Тема 4.1. «Теоретические основы лекарственной устойчивости микобактерий»

Количество аудиторных часов – 1

Примерный план лекции

Основные вопросы, освещаемые в лекции:

•лекарственная устойчивость микобактерий как механизм эволюции микобактерий туберкулеза;

•виды лекарственной устойчивости, причины формирования;

•перекрестная лекарственная устойчивость;

•критерии лекарственной устойчивости

Цель – формирование у слушателей представления о механизмах возникновения и видах лекарственной устойчивости микобактерий; понятия о перекрестной лекарственной устойчивости и критериев лекарственной устойчивости МБ.

Вводная часть (5–10 мин)

В вводной части по усмотрению лектора можно изложить основные дефиниции, используемые для этого раздела работ. Определение устойчивости микобактерий к противотуберкулезным препаратам (ПТП) имеет важное значение для выбора тактики химиотерапии больных, контроля за эффективностью лечения, определения прогноза заболевания и проведения эпидемиологического мониторинга лекарственной устойчивости. С целью повышения эффективности лечения больных необходимо знать механизмы и причины возникновения лекарственной устойчивости. Степень лекарственной устойчивости микобактерий определяется в соответствии с установленными критериями, которые зависят как от противотуберкулезной активности лекарственного препарата, так и его концентрации в очаге поражения, величины максимальной терапевтической дозы, фармакокинетики препарата и многих других факторов.

Основная часть (30 мин)

По современной классификации, специфические ПТП делятся на основные (первого ряда) и резервные (второго ряда). К препаратам первого ряда относятся изониазид, рифампицин, стрептомицин, пиразинамид и этамбутол, которые применяются для лечения больных с впервые выявленным заболеванием и рецидивами ту-

беркулеза. Они обладают бактерицидным действием и хорошо переносятся больными. К препаратам второго ряда относят канамицин, капреомицин, этионамид, циклосерин, парааминосалициловая кислота (ПАСК) и фторхинолоны (левофлоксацин, офлоксацин, ципрофлоксацин, левофлоксацин, моксифлоксацин, спарфлоксацин), а также производные от них и некоторых препаратов 1-го ряда: амикацин, рифабутин, микобутин, виомицин. Условно также выделяют препараты третьего ряда, которые обладают противотуберкулезной активностью, но схемы лечения ими находятся в разработке: это амоксиклав с клавуленовой кислотой, метронидазол, клофазимин, кларитромицин, тиацетазон. Препараты 2-го ряда обладают менее выраженным бактерицидным действием и обладают большим побочным эффектом. Микобактерии исходно обладают высокой природной устойчивостью ко многим антибактериальным препаратам широкого спектра действия. Различают первичную и вторичную лекарственную устойчивость МБТ.

Под первичной устойчивостью понимают таковую, когда устойчивая культура МБТ выявлена у впервые выявленного больного принимавшего ПТП не более месяца. Первичная лекарственная устойчивость имеет большое клиническое и эпидемиологическое значение.

Если исходно чувствительная культура МБТ, выделенная у пациента на фоне противотуберкулёзной терапии, приобрела в ходе лечения устойчивость, в этом случае говорят о приобретенной (вторичной) лекарственной устойчивости. В эпидемиологическом надзоре используют термин «устойчивость среди ранее леченых» больных туберкулезом.

Приобретение лекарственной устойчивости среди впервые выявленных больных, как правило, является результатом неадекватного лечения, связанного с неверным подбором препаратов, несоблюдением режима их приёма, снижением дозировок препаратов, плохим качеством препаратов и т.д. Эти факторы приводят к снижению концентрации препаратов в крови, приводя к значительному росту числа лекарственно-устойчивых форм и запуская в микобактериях механизмы L-трансформации. Данный вид устойчивости является объективным клиническим критерием неэффективно проводимой химиотерапии.

В структуре лекарственной резистентности микобактерий туберкулеза различают следующие виды:

РАЗДЕЛ 1. Лекционные материалы