6 курс / Клинические и лабораторные анализы / Лабораторная_диагностика_туберкулеза_Ерохин_В_В_ред_

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

•Множественная лекарственная устойчивость (МЛУ или MDR – Multidrug Resistance, англ.) – вид устойчивости МБТ к двум основным ПТП – изониазиду и рифампицину одновременно (независимо от наличия резистентности к другим препаратам).

•Экстенсивная или широкая лекарственная устойчивость (ШЛУ или XDR – Extensively Drug Resistance, англ.) – множественная лекарственная устойчивость в сочетании с устойчивостью к фторхинолонам и к одному из группы инъекционных препаратов: канамицину или/и амикацину или/и капреомицину.

•На практике важное значение имеет также перекрёстная устойчивость – явление, когда возникновение устойчивости к одному препарату влечет за собой устойчивость к другим препаратам. Развитие перекрёстной устойчивости обусловлено сходством химической структуры некоторых ПТП.

Лекарственная устойчивость, т.е. возможность размножаться в

присутствии лекарственных препаратов, является фундаментальным биологическим свойством не только для M.tuberculosis.

В настоящее время определены различные молекулярные механизмы устойчивости микобактерий туберкулёза к ПТП:

•инактивация антибиотика (ферментная инактивация), например, бета-лактамазами;

•модификация мишени действия (изменение пространственной конфигурации белка вследствие мутации соответствующего участка генома);

•гиперпродукция мишени, приводящая к изменению соотношения агент-мишень и высвобождению части белков жизнеобеспечения бактерии;

•активное выведение препарата из микробной клетки (эффлюкс) вследствие включения стрессорных механизмов защиты;

•изменение параметров проницаемости внешних структур микробной клетки, блокирующих способность антибиотика проходить внутрь клетки;

•включение метаболического «шунта» (обходного пути обмена). По общепринятому мнению, основными причинами развития

лекарственной устойчивости (ЛУ) M.tuberculosis к ПТП являются мутации в гене, ответственном за синтез белка-мишени действия препарата или в гене-регуляторе активности синтеза, гиперпродукция метаболитов, инактивирующих препарат, а также включение других механизмов, ведущих к потере эффективности препарата. Подобные мутации могут встречаться и у природных

(«диких») штаммов M.tuberculosis еще до их контакта с противотуберкулезными препаратами.

В большой и активно размножающейся микобактериальной популяции всегда имеется небольшое количество лекарственноустойчивых спонтанных мутантов. С учетом того, что в каверне величина микобактериальной популяции составляет 108–11, следует ожидать, что в ней имеются клетки, устойчивые ко всем ПТП. В очагах же и осумкованных казеозных фокусах 102–5 клеток устойчиво к ПТП. Поскольку большинство мутаций специфично для отдельных препаратов, спонтанные мутанты, как правило, возникают только к одному препарату.

Основным механизмом формирования лекарственной устойчивости является селекция, отбор лекарственно-устойчивых мутантов в присутствии ПТП. Накопление мутантных форм в микобактериальной популяции является основой развития лекарственной устойчивости к нескольким ПТП.

Устойчивость к тому или иному препарату не дает каких-либо преимуществ к выживанию для клеток M.tuberculosis до тех пор, пока популяция микобактерий не будет подвергаться воздействию данного препарата.

Механизмы устойчивости к основным ПТП Изониазид по существу представляет собой пролекарство. Для

проявления антибактериальной активности молекула препарата должна быть активирована внутри M.tuberculosis, однако химическая структура активной формы изониазида окончательно не выявлена. Активация происходит под действием фермента каталазы/пероксидазы (ген katG). Мутации в этом гене обнаруживают приблизительно у половины изониазидустойчивых штаммов M.tuberculosis. Каталазная активность регулируется также геном oxyR, мутации в котором могут приводить к устойчивости к изониазиду. Другим механизмом устойчивости M.tuberculosis к изониазиду является гиперпродукция мишеней действия активных форм препарата. К указанным мишеням относятся белки, участвующие в транспорте предшественников миколевых кислот и их биосинтез: ацетилированный белок-носитель (ген acpM), синтаза (ген kasA) и редуктаза (ген inhA) белка-носителя. Мутации обычно выявляются в промоторных областях перечисленных генов. Уровень устойчивости, связанный с гиперпродукцией мишеней, как правило, ниже, чем при мутациях в генах каталазы-пероксидазы в некоторых участках.

РАЗДЕЛ 1. Лекционные материалы

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Мутации inhA также придают устойчивость M.tuberculosis к этионамиду (протионамиду), и, по всей видимости, продукт гена inhA также является мишенью для данного препарата. Это объясняется тем, что для изониазида и этионамида (протионамида) общим предшественником является никотинамид и данные препараты имеют некоторое структурное сходство, так что. Пиразиноевую кислоту, и устойчивость к этионамиду иногда приобретается вместе с устойчивостью к изониазиду. Этионамид, вероятно, также является пролекарством, и ему необходима активация ферментом, который еще до сих пор не выявлен.

Установлено, что пиразинамид нарушает синтез жирных кислот клеточной стенки МБТ (ген pncA), а также нарушает процессы, связанные с переносом электронов в NAD-зависимых цепях (ген ndh), ассоциированные с широким кругом синтетических функций клетки.

Пиразинамид, как и изониазид, является пролекарством и их общим предшественником также является никотинамид. После пассивной диффузии внутрь клетки M.tuberculosis пиразинамид превращается в пиразиноевую кислоту под действием фермента пиразинамидазы (ген pncA). Пиразиноевая кислота, в свою очередь, ингибирует ферменты биосинтеза жирных кислот.

Мишенью действия рифампицина является фермент ДНК-за- висимая РНК-полимераза (ген rpoB). Устойчивость к рифампицину и его производным у M.tuberculosis в подавляющем большинстве случаев (более 95% штаммов) βсвязана с мутациями в сравнительно небольшом фрагменте – -субъединице этого фермента. В незначительной части случаев устойчивость к рифампицинам связана с мутациями в других участках гена rpoВ.

У штаммов M.tuberculosis, устойчивых к стрептомицину обнаружены мутации, приводящие к модификации участка связывания антибиотика с белком 12S малой субъединицы рибосомы (rpsL) и мутации в генах, кодирующих 16S субъединицу рРНК (rrs).

Есть и более редкая группа мутаций генов рибосом, которые настолько повышают устойчивость M.tuberculosis к стрептомицину, что эти мутанты называются стрептомицинзависимыми, поскольку плохо растут до тех пор, пока в питательную среду не добавляют стрептомицин.

Канамицин, амикацин и виомицин ингибируют синтез белка путем блокирования функции рибосом. Устойчивость M.tuberculosis к канамицину (амикацину) и виомицину кодируется геном rrs. Устойчивость к виомицину связана с геном vicB.

К аминогликозидам часто наблюдается перекрестная устойчивость. Молекулярная основа устойчивости к этим соединениям до конца неизвестна, однако у большинства устойчивых изолятов M.tuberculosis имеется мутация гена rrs 16S рРНК.

До сих пор не выяснен точный механизм действия этамбутола на клеточном и молекулярном уровне. Согласно одной из гипотез, этамбутол связывается с клеточной стенкой и угнетает синтез арабиногалактанов. Описан метаболический путь угнетения конверсии глюкозы в моносахариды, используемые при синтезе полисахаридов клеточной стенки – арабиногалактана, арабиноманнана и пептидогликана.

Мишенью действия этамбутола является белок EmbB (арабинозилотрансфераза), участвующий в биосинтезе компонента клеточной стенки M.tuberculosis – арабиногалактана. Устойчивость к этамбутолу, в подавляющем большинстве случаев, связана с точечной мутацией в 306 кодоне гена embB.

Фторхинолоны, являясь антимикробными препаратами широкого спектра действия, проявляют сильную бактерицидную активность в отношении как М.leprae, так и M.tuberculosis. К противотуберкулезным фторхинолонам относятся ломефлоксацин, офлоксацин, ципрофлоксацин, левофлоксацин, спарфлоксацин и моксифлоксацин.

Фторхинолоны угнетают синтез ДНК в результате связывания с бактериальной топоизомеразой II. У штаммов M.tuberculosis, устойчивых к фторхинолонам, выявлены мутации в гене gyrA, который кодирует второй тип ДНК-топоизомеразы – ДНК-гиразу. У M.tuberculosis мутанты со спонтанной устойчивостью к ципрофлоксацину появляются с частотой от 107 до 108.

Одним из возможных механизмов действия циклосерина на M.tuberculosis может быть подавление синтеза широкого ряда пептидогликанов путем блокирования действия D-аланинрацемазы и D-аланинсинтетазы. Устойчивость M.tuberculosis к этому препарату может являться следствием модификации и гиперпродукции указанных ферментов, что косвенно подтверждается зависимостью устойчивости M.smegmatis к циклосерину от наличия гена D-ала- нинрацемазы alrA.

Генетические механизмы развития лекарственной устойчивости M.tuberculosis лежат в основе явления перекрестной устойчивости (кросс-резистентности), когда наблюдается генетически обусловленная лекарственная устойчивость к нескольким препаратам одновременно. Так, устойчивость M.tuberculosis к этио-

РАЗДЕЛ 1. Лекционные материалы

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

намиду (протионамиду) можно встретить у больных, никогда не получавших этот препарат, если M.tuberculosis, выделенные у данного больного, уже устойчивы к изониазиду. Мутация гена и продукция дефектного белка inhA (иноилредуктаза) приводят к нарушению конечного этапа синтеза жирных кислот клеточной стенки, который является мишенью действия и изониазида, и этионамида (протионамида). Перекрестная устойчивость характерна для изониазида и его производных (феназида, фтивазида и метазида), для рифампицина и его производных (рифабутина и рифампентина), для аминогликозидов (стрептомицина, канамицина и амикацина), для полипептидов (капреомицина и виомицина) и для всех противотуберкулезных фторхинолонов.

Критерии лекарственной устойчивости

Принято уровень устойчивости некоего штамма в целом выражать той максимальной концентрацией препарата (количество мкг в 1 мл питательной среды), при которой еще наблюдается размножение МБ (по числу колоний на плотных средах). Лекарственноустойчивые микроорганизмы способны размножаться при таком содержании препарата в среде, которое оказывает на чувствительные особи бактериостатическое или бактерицидное воздействие.

Критические концентрации. Для препаратов установлена определенная критическая концентрация. Она имеет клиническое значение, так как отражает воздействие препарата на МБТ в условиях макроорганизма. Критерий устойчивости микобактериальной популяции – показатель роста микобактериального пула, выраженный в абсолютных (число КОЕ) или относительных единицах (пропорция КОЕ) на питательной среде, содержащей ПТП в критической концентрации, превышение которого считается наличием признака устойчивости МБ.

Заключительная часть (5 мин)

В заключение темы лекции следует обратить внимание слушателей на то, что знание механизмов устойчивости к ПТП позволяет ответить на сложные вопросы фтизиатров по причинам возникновения и амплификации ЛУ, более обоснованного назначения ПТП и их замещения с учетом перекрестной устойчивости, аффинности ПТП к клеточной стенке МБТ, проницаемости. Как пример можно привести следующее: замена в группе фторхинолонов производится с учетом минимальной ингибирующей концентрации (МИК), характера мутаций. Начинают с препарата, обладающего

более высокой МИК ПТП из группы (левофлоксацин – офлоксацин – моксифлоксацин – гатифлоксацин).

Достоверное определение степени и спектра устойчивости клинических штаммов МБТ к ПТП имеет важное значение во всех клинико-эпидемиологических аспектах.

Рекомендуемая литература

1.Культуральные методы диагностики туберкулеза. Учебное пособие для проведения базового курса обучения специалистов бактериологических лабораторий учреждений противотуберкулезной службы. – М.–Тверь: Триада. 2008. – 208 с.

2.Национальное руководство ФТИЗИАТРИЯ. Под общей ред. М.И. Перельмана. – М.: ГЕОТАР-Медиа, 2007. – 512 с.

3.Приказ МЗ РФ № 109 от 21 марта 2003 г. «О совершенствовании противотуберкулезных мероприятий в Российской Федерации.

4.Руководство по медицинской микробиологии. Частная медицинская микробиология и этиологическая диагностика инфекций. Книга II. Под ред. Лабинской А.С., Костюковой Н.Н., Ивановой С.М. – М.: Издательство БИНОМ, 2010. – 1152 с.

5.Hahn H., Kaufmann S.H.E., Schulz T.F., Suerbaum S. Medizinische Microbiologie und Infectologie // Springer Heidelberg – 2009. – T.42. – S. 354–369.

6.Kent P.T., Kubica G.P. Public Health Mycobacteriology. A Guide for the Level I–III Laboratory. Centers for Disease Control,1985.

7.Laboratory services in tuberculosis control. Part III: Culture. – 1998.

– 96 pp.

8.Lung biology in Health and Disease. Vol. 219. Reichman ahd Hershfield’ Tuberculosis. A comprehensive, International Approach. Third Edition. Informa Healthcare USA. – 2006.–715.

Материально-техническое обеспечение

Мультимедийная или проекционная демонстрационные системы, экран, лазерная указка; набор тематических слайдов.

РАЗДЕЛ 1. Лекционные материалы

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Тема 4.2. «Классические бактериологические методы определения лекарственной чувствительности микобактерий туберкулеза»

Количество аудиторных часов – 1

Примерный план лекции

Основные вопросы, освещаемые в лекции:

•методы: абсолютных концентраций, пропорций, коэффициента резистентности;

•сравнительные характеристики и приоритеты выбора методов; Цель – формирование у слушателей представления о бактерио-

логических методах определения лекарственной чувствительности микобактерий туберкулеза и приоритетах при выборе методов исследования

Вводная часть (5–10 мин)

В вводной части по усмотрению лектора можно изложить основные дефиниции, используемые для этого раздела работ.

Целесообразно изложить кратность и сроки определения лекарственной чувствительности МБТ:

•до начала лечения однократно для определения стратегии и тактики лечения;

•при изоляции от больного нескольких культур из однородного материала (мокрота) за короткий промежуток времени исследуется ЛЧ одного из штаммов;

•при изоляции от больного культур из различного материала (мокрота, БАС, моча, экссудаты, ликвор и др.) исследуются все выделенные штаммы;

•в конце интенсивной фазы лечения при отсутствии положительной клинико-рентгенологической динамики;

•при необходимости изменения схемы лечения, например, при ухудшении состояния больного, при плохой переносимости ПТП.

Основная часть (30 мин)

В основной части следует кратко дать обзор характеристик используемых методов. Обычно устойчивость проявляется в виде визуально наблюдаемого роста колоний МБТ, однако существуют методики, указывающие на рост в ранних стадиях развития культуры клеток микобактерий, в виде цветных реакций. Эти методы сокращают время проведения теста с 3–4 недель до 2–3 недель. В настоящее время общеприняты несколько микробиологических ме-

тодов определения ЛЧ МБТ. ВОЗ рекомендует эти методы для непрямого определения ЛЧ МБТ: метод пропорций, предложенный в 1963 г. Canetti, Rist and Grosset и детализированный в 1985 г. Middlebrook and Cohn; метод коэффициента устойчивости, разработанный в 1961 г. Mitchison и др.; метод абсолютных концентраций на плотных и жидких средах, модифицированный в 1970 г. Meissener.

Критерии лекарственной устойчивости

Принято уровень устойчивости некоего штамма в целом выражать той максимальной концентрацией препарата (количество мкг в 1 мл питательной среды), при которой еще наблюдается размножение МБ (по числу колоний на плотных средах). Лекарственноустойчивые микроорганизмы способны размножаться при таком содержании препарата в среде, которое оказывает на чувствительные особи бактериостатическое или бактерицидное воздействие.

Критические концентрации. Критерии лекарственной устойчивости. Для препаратов установлена определенная критическая концентрация. Она имеет клиническое значение, так как отражает воздействие препарата на МБТ в условиях макроорганизма. Критерий устойчивости микобактериальной популяции – показатель роста микобактериального пула, выраженный в абсолютных (число КОЕ) или относительных единицах (пропорция КОЕ) на питательной среде, содержащей ПТП в критической концентрации, превышение которого считается наличием признака устойчивости МБ.

К примеру, для метода абсолютных концентраций появление более 20 КОЕ МБ на питательной среде, содержащей ПТП в критической концентрации, свидетельствует о том, что данный штамм МБ обладает лекарственной устойчивостью. Необходимо иметь в виду, что объем засеваемой суспензии клеток стандартизован и соответствует 1 x 107 микробных тел.

Следует учитывать, что для разных по составу питательных сред критическая концентрация одного и того же ПТП различна. Значения критических концентраций существенно отличаются также при использовании разных методов определения лекарственной чувствительности. Следует подчеркнуть, что критические концентрации ПТП II ряда для метода абсолютных концентраций все еще носят ориентировочный характер и требуют дальнейшей коррекции.

В качестве унифицированного в России получил распространение метод абсолютных концентраций. Более детально рассмотреть

РАЗДЕЛ 1. Лекционные материалы

При разведении ПТП и приготовлении питательных сред следует учитывать следующие правила:

•Среда Левенштейна-Йенсена не должна содержать крахмал.

•Рабочие разведения противотуберкулезных препаратов готовят непосредственно перед свертыванием питательных сред.

•Для приготовления питательных сред должны использоваться химически чистые субстанции ПТП;

•При приготовлении разведений ПТП следует учитывать его активность, степень чистоты и содержание влаги.

Активность препарата может варьировать от одной его серии к

другой серии. Сведения об активности приводятся на этикетках или упаковках лекарственных препаратов и могут быть получены от фирмы-изготовителя.

Заключительная часть (5 мин)

В заключение темы лекции следует обратить внимание слушателей на необходимость качественного и точного выполнения методик при проведении данного вида исследований Метод абсолютных концентрация является с методической точки зрения относительно простым, однако требующим высокой стандартизации и точности выполнения лабораторных процедур. Устойчивость МБТ к ПТП может отличаться по спектру препаратов, степени, частоте и скорости появления устойчивости.

РАЗДЕЛ 1. Лекционные материалы