6 курс / Клинические и лабораторные анализы / Лабораторная_диагностика_туберкулеза_Ерохин_В_В_ред_

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Все вместе эти проблемы порождают «порочный круг», приводящий к несвоевременной диагностике микобактериозов.

Сейчас врачи-фтизиатры могут руководствоваться редкими отечественными научными статьями, посвященными диагностике и лечению микобактериоза, а также зарубежной специальной литературой и нормативными документами.

НТМБ как «маска» ШЛУ ТБ

Симптомы микобактериозов весьма разнообразны и неспецифичны. Большинство пациентов предъявляют жалобы на длительный или периодически возникающий кашель, чаще сухой, иногда с мокротой. Больных беспокоят слабость, недомогание, умеренная одышка, иногда эпизоды кровохарканья, боли в грудной клетке, субфебрилитет, потеря массы тела. Картина очень похожа на заболевание туберкулезом. Чаще всего больные с микобактериозами попадают в противотуберкулезные учреждения с подозрением на туберкулез. Поэтому очень важно проводить грамотную идентификацию полученных культур. Ведь основным методом диагностики НТМБ в настоящее время остается посев на плотные и жидкие питательные среды, используемые и для выявления микобактерий туберкулеза. Без проведения идентификационных тестов быстрорастущие или пигментированные микобактерии могут быть приняты за постороннюю флору и удалены из анализа, а медленнорастущие НТМБ могут быть признаны за M.tuberculosis, поставлен тест на лекарственную устойчивость и результаты выданы врачам-фтизиатрам.

Нетуберкулезные микобактерии (НТМБ), несмотря на то, что принадлежат к роду Mycobacterium, в подавляющем числе случаев имеют природную устойчивость к большинству противотуберкулезных препаратов. Ошибочная диагностика может привести к постановке диагноза «туберкулез с широкой лекарственной устойчивостью».

Установление лекарственной чувствительности НТМБ

По опыту зарубежных исследователей (Японии и США) для лечения микобактериозов, наряду с противотуберкулезными препаратами, применяются антибиотики широкого спектра действия: кларитромицин, тобрамицин, амоксициллин/клавулоновая кислота, импинем, тайгециклин, доксициклин и т.д. Поэтому необходимо для НТМБ проводить тест на определение ЛЧ не только к противотуберкулезным препаратам, но и к препаратам широкого спектра действия. Критических концентраций препаратов для

НТМБ не разработано, поэтому для каждого препарата определяется минимальная ингибирующая концентрация (МИК).

На отечественном рынке продается тест-система планшетного формата для определения МИК для быстрорастущих и для медленнорастущих НТМБ Sensititre производства Trek Diagnostic Systems, Magellan Biosciences, UK.

В 96-луночном планшете на дне лунок лиофилизированы препараты в разных концентрациях. В лунки добавляется среда с исследуемой культурой НТМБ. Планшет инкубируется при 35°С в течение 3–7 дней для быстрорастущих видов НТМБ и от 7 до 14 дней для медленнорастущих. Результаты роста культуры на среде с различными концентрациями препаратов считываются или вручную под инвертированным микроскопом, или с использованием автоматического анализатора Sensititre Vizion System®.

Спектры лекарственной устойчивости к препаратам разных видов НТМБ: Устойчивость к большинству ПТП микобактерий, выделенных у больных микобактериозом, существенно ограничивает терапевтические возможности, и речь может идти только об индивидуализированном лечении, основанном на определении лекарственной чувствительности к широкому спектру антибактериальных препаратов.

Примеры спектров лекарственной устойчивости к ПТП и антибиотикам широкого спектра действия представлены на слайдах.

Как видно из приведенных данных, микобактерии, выделенные от пациентов с диагнозом микобактериоз НТМБ, особенно быстрорастущие, были устойчивы к большинству антибактериальных препаратов

Частота выявления НТМБ в клинике с использованием молекулярно-генетических методов

К сожалению, очень мало отечественных статистических данных о выявлении микобактериозов и НТМБ в лабораториях, потому что отсутствуют точные критерии соответствия микробиологических данных и клинических проявлений. Следует помнить, что источником НТМБ является окружающая среда, поэтому выявление НТМБ в диагностическом материале может быть результатом контаминации. Для предотвращения контаминации необходимо соблюдать санитарные нормы и правила, предусмотренные для противотуберкулезных лабораторий (регулярная обработка помещений и рабочих мест дезинфицирующими растворами, дезинфекция многоразовых инструментов). Однократное выделение

РАЗДЕЛ 1. Лекционные материалы

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

НТМБ в образце от больного также не может являться критерием для постановки диагноза микобактериоз.

Для регламентации процесса установления диагноза и лечения микобактериозов Американское торакальное общество (ATS) совместно с Американским обществом по инфекционным болезням в 2007 г. опубликовало руководство, посвященное заболеваниям, вызываемых НТМБ, и выделило основные диагностические критерии. Одним из основных микробиологических критериев является неоднократное выделение от больного одного и того же штамма НТМБ

Можно привести данные по частоте выявляемости НТМБ в бактериологических лабораториях двух крупных противотуберкулезных центров:

•Центральный НИИ туберкулеза РАМН. Из 1605 выделенных культур 84 были отнесены к НТМБ, что составило 5,2%.

•МНПЦБТ. Провели 117579 посевов, выделили 15786 (13,4%) культур микобактерий, из них к M.tuberculosis complex отнесено 15333 (97,1%) культуры и 490 культур – к НТМБ, что составило 3,1% от общего числа культур микобактерий.

Заключительная часть (5 мин)

«Недостаточная осведомленность врачей-фтизиатров в вопросах диагностики, клиники и лечения микобактериоза приводит к несвоевременному его выявлению.

…Своевременность диагностики микобактериоза зависит от

полноценного бактериологического обследования больного и быстроты получения результатов идентификации выделенных культур. Поздняя диагностика заболевания и несвоевременно начатая специфическая терапия приводит к развитию тяжелого, прогрессирующего процесса с деструктивным поражением легких»

Т.Ф. Оттен, А.В. Васильев. «Микобактериоз», С-Пб., 2005

В добавление к цитате хотелось бы отметить, что только настороженность врачей на обнаружение данного заболевания, а также правильный подход к микробиологической диагностике НТМБ может позволить поставить верный диагноз и быстро начать адекватную химиотерапию.

Рекомендуемая литература

1.Литвинов В.И., Макарова М.В., Краснова М.А. «Нетуберкулезные микобактерии». – М.: МНПЦБТ. – 2008. – 256 с.

2.Оттен Т.Ф., Васильев А.В. Микобактериоз. – СПб: Медицинская пресса. – 2005. – 224 с.

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

МОДУЛЬ 11. Молекулярно-генетические основы резистентности микобактерий

Тема 11.1. «Гены микобактерий, ответственные за устойчивость к ПТП»

Количество аудиторных часов – 1

Примерный план лекции

Основные вопросы, освещаемые в лекции:

•Гены, ответственные за устойчивость к ПТП первого ряда

•Гены, ответственные за устойчивость к некоторым ПТП второго ряда

•Механизмы возникновения лекарственной устойчивости к основным препаратам

Вводная часть (5–10 мин)

ВОЗ продекларировал, что одна треть мировой популяции инфицирована микобактериями туберкулеза – 2 миллиарда человек.

Случаи туберкулеза во многих индустриальных странах увеличились в последние два десятилетия и, похоже, продолжают увеличиваться.

Особую и весьма значительную роль в обострении ситуации с туберкулезом играет появление и все большее распространение штаммов микобактерий, устойчивых к лекарственным препаратам. Наибольшую опасность представляют штаммы M.tuberculosis, обладающие множественной лекарственной устойчивостью – МЛУ (Multidrug Resistant, MDR – устойчивые к двум основным противотуберкулезным препаратам: рифампицину и изониазиду) или широкой лекарственной устойчивостью – ШЛУ (т.н. Extensively Drug-Resistant, XDR – устойчивые к рифампицину, изониазиду, фторхинолонам и одному из инъекционных противотуберкулезных препаратов второй группы). По некоторым данным, в мире около 4% случаев туберкулеза вызываются МЛУ-штаммами, а среди ранее леченных больных частота выявления МЛУ-штам- мов доходит до 40%. ШЛУ-штаммы распространены пока не столь широко, однако в мире наблюдается устойчивая тенденция к их распространению. Таким образом, в недалеком будущем современная медицина, лишенная эффективных химиотерапевтических средств, воздействующих на микобактерии, может оказаться безоружна перед лицом возрастающей угрозы повсеместного распространения устойчивых штаммов M.tuberculosis.

Очевидно, что в сложившейся ситуации весьма актуальны исследования, направленные на решение проблемы быстрой диагностики заболевания, своевременного выявления устойчивых форм, а также на проведение адекватных противоэпидемических мероприятий, ориентированных на предупреждение распространения штаммов микобактерий (в том числе и устойчивых) в человеческой популяции.

Большие перспективы и возможности в этом направлении открывают современные достижения молекулярной биологии. На их основе в настоящее время активно разрабатываются и внедряются в клиническую практику новые молекулярно-генетические методы, позволяющие осуществлять быструю диагностику туберкулеза. Однако разработка новых методов невозможна без понимания механизмов возникновения лекарственной устойчивости микобактерий туберкулеза.

Основная часть (30 мин)

Молекулярные механизмы возникновения лекарственной устойчивости. В основе действия практически всех антибиотиков лежит связывание их с жизненно необходимыми белками бактериальных клеток и блокирование их функций. Белки кодируются генами. Если в гене бактерий возникнет мутация, структура синтезируемого белка изменяется. Препарат больше не может связаться с таким измененным белком (или связь с белком слишком слабая) и не блокирует его. Таким образом, мутации в геноме микобактерий ответственны за возникновение лекарственной устойчивости.

Появление устойчивых штаммов. Мутации в геноме микобактерий возникают спонтанно и связаны с ошибками редупликации ДНК при делении клеток. Мутировавшие клетки не имеют преимуществ перед немутировавшими. Наоборот, некоторыми работами показано, что такие мутанты имеют сниженную жизнеспособность. Однако, при селективном давлении антибиотиков, т.е. при лечении больного, мутантные клетки, которые не погибают от ПТП, сразу получают большие преимущества. В то время как популяция немутировавших микобактериальных клеток вымирает, мутанты выживают и размножаются в организме.

РАЗДЕЛ 1. Лекционные материалы

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Гены, ответственные за устойчивость к ПТП первого ряда

Гены, ответственные за устойчивость к некоторым ПТП второго ряда

Молекулярные механизмы формирования устойчивости к ПТП Рифампицин (1 ряд). Оказывает бактерицидное действие на ак-

тивно делящиеся микобактерии, локализованные как внеклеточно, так и внутриклеточно, а также на микобактерии в неактивном состоянии. Проникая через клеточныеβ оболочки микобактерии, рифампицин связывается с -субъединицей бактериальной РНК полимеразы и блокирует таким образом процесс транскрипции.

Было обнаружено, что нуклеотидные замены, приводящие к устойчивости, в основном встречаются между 507 и 533 кодонами гена rpoB – до 96 % всех рифампицин-резистентных штаммов имеют мутации в этой области, так называемом регионе, определяющем устойчивость к рифампицину (англ. rifampin resistance determinant region (RRDR)). Наиболее часто (до 86 % случаев) встречаются замены в 531, 526 и 516 кодонах. Также была выявлена взаимосвязь между локализацией мутаций с уровнем устойчивости микроорганизма: мутации в 531, 526 и 513 кодонах приводят к устойчивости высокого уровня, замены в других кодонах связаны с умеренной устойчивостью. 4% фенотипически устойчивых к рифампицину штаммов M.tuberculosis не несут мутаций в гене rpoB. Механизм устойчивости таких штаммов остается пока неизвестным. Вероятнее всего, существует добавочный механизм устойчивости к рифампицину, возможно, связанный с нарушением проницаемости клеточной стенки для препарата или мутациями в других субъединицах РНК-полимеразы.

Изониазид (1 ряд). Изониазид ингибирует биосинтез миколовых кислот клеточной стенки. МБТ становятся чувствительными к активным кислородным радикалам и другим воздействиям окружающих факторов. Активный INH+ продукт образуется при окислении изониазида ферментом каталазой-пероксидазой KatG (продукт гена katG). Мутации в гене katG приводят к образованию дефектного или отсутствию фермента KatG. Это делает невозможным перевод неактивной формы изониазида в активную INH+, следовательно, возникает устойчивость МБТ к изониазиду.

Такой механизм был выявлен у 85% INH-устойчивых штаммов. Наиболее часто в гене katG встречается замена Ser315>Thr (у 40% МБТ). При этом 50% активности каталазы-пероксидазы сохраняется. Такая каталаза-пероксидаза теряет способность активировать изониазид, однако сохраняет свою способность детоксицировать органические перекиси.

Результатом этого является высокий уровень резистентности к изониазиду (>90 мкг/мл). Штаммы МБТ с другими мутациями в гене katG редко встречаются и демонстрируют различный уровень резистентности к изониазиду. Изониазид действует только на МБТ, т.к. только у МБТ каталаза-пероксидаза имеет побочную функцию

– окисляет изониазид, превращая его в активную форму INH+. При возникновении мутаций в гене katG и нарушении синтеза

каталазы-пероксидазы, отвечающих у всех бактерий за детоксикацию клетки от органических перекисей, у МБТ включается защит-

РАЗДЕЛ 1. Лекционные материалы