6 курс / Клинические и лабораторные анализы / Лабораторная_диагностика_туберкулеза_Ерохин_В_В_ред_

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

МОДУЛЬ 9. Молекулярно-генетические методы для выявления микобактерий туберкулезного комплекса и НТМ

Тема 9.1. «Основные мишени в геноме микобактерий, лежащие в основе молекулярной диагностики»

Количество аудиторных часов – 1

Примерный план лекции

Основные вопросы, освещаемые в лекции:

•Критерии выбора мишени для ПЦР-диагностики

•Основные гены – мишени для ПЦР-диагностики МБТ

•Гены-мишени для ПЦР-диагностики основных клинически значимых видов НТМБ.

Вводная часть (5–10 мин)

Современная диагностика инфекционных заболевания немыслима без быстрых и точных молекулярно-генетических методов выявления, идентификации и установления лекарственной чувствительности возбудителей. В основе практически всех молекулярных подходов к решению этой задачи лежит полимеразная цепная реакция (ПЦР) в различных вариантах. ПЦР-метод, позволяющий нарабатывать в пробирке большое количество коротких фрагментов определенного участка ДНК.

Впервые о возможности искусственного синтеза ДНК заговорили в 1970-х годах, когда норвежский ученый Хейлль Клеппе предложил провести реакцию амплификации ДНК, однако его идея не была реализована. В 1983 году американский ученый Кэри Мюллис впервые синтезировал большое количество фрагментов ДНК, используя фермент ДНК-полимеразу и подвергая реакционную смесь циклическому нагреванию-охлаждению. Этот метод впоследствии получил название полимеразной цепной реакции. В 1993 году за это открытие Кэрри Мюллис получил Нобелевскую премию.

Этапы проведения ПЦР:

1.Выделение ДНК из биологического материала.

2.Собственно ПЦР (проведение реакции амплификации интересующего исследователя фрагмента ДНК)

3.Визуализация продуктов амплификации (в электрофорезном геле, в режиме реального времени).

Основные "участники" ПЦР-реакции:

1.ДНК-мишень

2.Праймеры, комплементарные определенному участку ДНКмишени

3.Фермент ДНК-полимераза

4.dNTP – дезоксинуклеотидтрифосфаты.

делает его менее популярной мишенью для ПЦР-диагностики по сравнению с IS6110, среднее число копий в геноме которой достигает 13–14.

Ген hsp65. Кодирует белок теплового шока весом 65 кДа. Белки теплового шока были найдены в клетках любых организмов. Экспрессия этих белков повышается, если клетка попадает в стрессовые условия, например, при повышении температуры. Играют защитную роль – стабилизируют работу других белков. Последовательность нуклеотидов, кодирующих белки теплового шока имеет участки, специфичные для каждого вида, поэтому может использоваться в качестве мишени для ПЦР-диагностики.

Ген, кодирующий антиген 38 кДа. Присутствует только в геноме

M.tuberculosis complex, что делает его привлекательным для выбора в качестве мишени.

Ген, кодирующий 16S рибосомальную РНК. Содержит участки, присутствующие только у M.tuberculosis complex. Используется в качестве мишени в тест-системах Amplicor (Roche Molecular Systems)

Ген hupB. Кодирует гистоноподобный белок. Содержит последовательности, специфичные для M.tuberculosis и специфичные для M.bovis, что позволяет использовать его в качестве мишени для выявления M.bovis и дифференциации M.bovis от M.tuberculosis.

Гены-мишени для ПЦР-диагностики основных клинически значимых видов НТМБ

Нетуберкулезные микобактерии (НТМБ) являются этиологическим фактором микобактериозов. В настоящее время отмечается значительный рост заболеваемости микобактериозами. Наиболее быстрым методом, обладающим максимально возможной специфичностью и чувствительностью, позволяющим выявить и дифференцировать штаммы НТМБ от штаммов, принадлежащих к M.tuberculosis complex, является ПЦР.

В настоящее время разрабатываются ПЦР-тест системы, дифференцирующие НТМБ от представителей M.tuberculosis complex, а также тест-системы, непосредственно в диагностическом материале выявляющие патогены, принадлежащие к разным видам НТМБ.

Вставочная последовательность IS1245. Мобильный элемент генома, специфичный для M.avium (вызывает поражения легких, одна из наиболее частых коинфекций при СПИДе) В геноме M. avium содержится несколько копий IS1245, что делает ПЦР

РАЗДЕЛ 1. Лекционные материалы

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

более чувствительной. Этот мобильный элемент содержится также и в геноме подвида M.avium subsp. paratuberculosis.

Вставочная последовательность IS901. Мобильный элемент генома, специфичный для M.avium. позволяет дифференцировать M.avium от подвидов.

Вставочная последовательность IS900. Является дифференцирующим маркером для M.avium subsp. paratuberculosis

Регион, кодирующий 16S–23S рибосомальной РНК. Штаммы, принадлежащие к разным видам НТМБ, имеют в этом регионе генома специфические для своего вида участки. ПЦР с праймерами, комплементарными этим участкам может выявлять до 30 видов НТМБ (M.avium ssp., M.chelonae, M.abscessus, M.fortuitum, M.gordonae, M.intracellulare, M.scrofulaceum, M.interjectum, M.kansasii, M. malmoense, M.peregrinum, M.marinum, M.ulcerans, M.xenopi, M. simiae, M.mucogenicum, M.goodii, M.celatum, M.smegmatis, M.genavense, M.lentiflavum, M.heckeshornense, M.szulgai, M.intermedium, M.phlei, M.haemophilum, M.kansasii, M.ulcerans, M.gastri, M.asiaticum, M.shimoidei).

Ген hsp65. Этот ген, кодирующий белок теплового шока микобактерий, может с успехом использоваться как для выявления МБТ, так и для выявления НТМБ (членов MAC, M.chelonae, M.abscessus).

Ген, кодирующий супероксиддисмутазу (SOD). Последовательность этого гена, содержащая вариабельные участки, специфические для разных видов НТМБ, позволили исследователям синтезировать праймеры, специфичные для M.avium, M.fortuitum,

M. gordonae, M.intracellulare, M.kansasii, M.scrofulaceum, M.simiae, M.xenopi.

Заключительная часть (5 мин)

Заключительную часть рекомендуется посвятить ответам на вопросы и/или по желанию лектора могут быть обсуждены материалы ранее опубликованных научных работ

Рекомендуемая литература

1.Ребриков Д.В., Саматов Г.А., Трофимов Д.Ю. и соавт. ПЦР «в реальном времени». Под ред. Д.В. Ребрикова, – изд 2-е, испр. и доп. – М.: БИНОМ. Лаборатория знаний. – 2009. – 223 с.

2.Ahmed N., Mohanty A.K., Mukhopadhyay U., Batish V.K., Grover S. PCR-Based Rapid Detection of Mycobacterium tuberculosis in blood from immunocompetent patients with pulmonary tuberculosis // J Clin Microbiol. – 1998. – Vol. 36 (10). – P. 3094–3095.

3.Collins D.M., Stephens D.M. Identification of an insertion sequence, IS1081, in Mycobacterium bovis // FEMS Microbiol Lett. – 1991. – Vol. 67(1). – P. 11–15.

4.Kox L.F., van Leeuwen J., Knijper S., Jansen H.M., Kolk A.H. PCR assay based on DNA coding for 16S rRNA for detection and identification of mycobacteria in clinical samples // J. Clin. Microbiol. – 1995. – Vol. 33 (12) – P. 3225–3233.

5.Mahillon J., Chandler M. Insertion Sequences // Microbiology and Molecular Biology Reviews. – 1998. – P. 725–774.

6.Park H., Jang H., Kim C., Chung B., Chang C.L., Park S.K., Song S. Detection and identification of Mycobacteria by amplification of the internal transcribed spacer regions with genusand species-spe- cific PCR primers // J. Clin. Microbiol. – 2000. – Vol. 38. – P. 4080– 4085.

7.Prabhakar S., Mishra A., Singhal A., Katoch V.M., Thakral S.S., Tyagi J.S., Prasad H.K. Use of the hupB gene encoding a histone-like protein of Mycobacterium tuberculosis as a target for detection and differentiation of M.tuberculosis and M.bovis // J. Clin. Microbiol. – 2004. – Vol. 42. – P. 2724–2732.

8.Thibault V.C., Grayon M., Boschiroli M. L., Hubbans., Overduin P., Stevenson K., Gutierrez M.C., Supply Ph., Biet F. New VariableNumber Tandem-Repeat markers for typing Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis and M.avium strains: comparison with IS900 and IS1245 Restriction Fragment Length Polymorphism typing. Published ahead of print 30 May 2007, doi: 10.1128/JCM.00476-07

9.van Soolingen D., Hermans P.W., de Haas P.E., van Embden J.D. Insertion element IS1081-associated restriction fragment length polymorphisms in Mycobacterium tuberculosis complex species: a reliable tool for recognizing Mycobacterium bovis BCG // J. Clin. Microbiol.

– 1992. – Vol. 30(7). – P. 1772–1777.

10.Zolg J.W., Philippi-Schulz S. The superoxide dismutase gene, a target for detection and identification of mycobacteria by PCR // J.Clin. Microbiol. – 1994. – Vol. 32. – P. 2801–2812.

Материально-техническое обеспечение

Мультимедийная или проекционная демонстрационная системы, экран, лазерная указка; набор тематических слайдов.

РАЗДЕЛ 1. Лекционные материалы

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Тема 9.5. «Эффективность использования ПЦР для диагностики туберкулеза в клинике»

Количество аудиторных часов – 1

Примерный план лекции

Основные вопросы, освещаемые в лекции:

•Сравнение результатов ПЦР-диагностики с традиционными методами выявления микобактерий.

•Место ПЦР-анализа в лабораторной диагностике туберкулеза

Вводная часть (5–10 мин)

В арсенале современной микробиологической лаборатории должны находиться все доступные методы, помогающие врачуфтизиатру точно установить диагноз и назначить адекватную химиотерапию в кратчайшие сроки. В задачи микробиологической лаборатории фтизиатрического профиля входит:

1.Обнаружение возбудителя туберкулеза в диагностическом материале, посланном на исследование.

2.Идентификация возбудителя, дифференцирование от нетуберкулезных микобактерий (НТМБ) и посторонней флоры

3.Если в диагностическом материале выявлены НТМБ, то проведение их идентификации до вида

4.Установление лекарственной чувствительности (ЛЧ) возбудителя туберкулеза и микобактериоза.

Классические микробиологические методы обнаружения возбудителя туберкулеза/микобактериоза:

1.Микроскопия нативного диагностического материала (мокроты, БАС, раневого отделяемого, ликвора, синовиальной жидкости и др.) с окраской по Ziehl-Neelsen

2.Микроскопия осадка диагностического материала с окраской люминесцентными красителями

3.Посев осадка диагностического материала на плотные яичные среды (Левенштейна-Йенсена, Финн-II)

4.Посев осадка диагностического материала на жидкую питательную среду Middlebrook 7H9 и детекция роста в автоматизированной системе BACTEC MGIT 960

5.Биологическая проба

Классические микробиологические методы идентификации возбудителя туберкулеза/микобактериозов

1. Первичная идентификация по скорости роста на средах, цвету и морфологии колоний