6 курс / Клинические и лабораторные анализы / Лабораторная_диагностика_туберкулеза_Ерохин_В_В_ред_

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

ние бактериовыделения у 98,6% больных МЛУ ТБ через 6 месяцев после начала лечения); повышает эффективность лечения и предотвращает распространение лекарственно-устойчивых штаммов микобактерий. Обращается внимание слушателей, что подробное описание методов, упомянутых в лекции, будет получено при прослушивании тематического курса.

Рекомендуемая литература

1.Лунин В.Г., Тополян А.А., Колупаев В.Е., Сердобинский Л.А. Организация работы лаборатории, использующей для проведения исследований метод полимеразной цепной реакции с детекцией в режиме реального времени. Методические рекомендации. – Тверь: Триада. – 2008. – 24 с.

2.Методические указания (МУ 1.3.1888-04) «Организация работы при исследованиях методом ПЦР материала, инфицированного патогенными биологическими агентами III–IV групп патогенности».

3.Приказ МЗ РФ от 21.03.03 № 109 «О совершенствовании противотуберкулезных мероприятий в Российской Федерации»

4.Ребриков Д.В., Саматов Г.А., Трофимов Д.Ю. и соавт. ПЦР «в реальном времени». Под ред. Д.В. Ребрикова, – изд 2-е, испр. и доп. – М.: БИНОМ. Лаборатория знаний. – 2009. – 223 с.

5.Черноусова Л.Н. Алгоритм микробиологических исследований для диагностики туберкулезной инфекции Методическое пособие для врачей (сокращенный вариант) // Туберкулез и болезни легких. Нью-терра. – 2011. – №11. – С. 58–67

6.Черноусова Л.Н., Севастьянова Э.В., Андреевская С.Н., Ларионова Е.Е., Смирнова Т.Г. Алгоритм микробиологических исследований для диагностики туберкулезной инфекции. Методическое пособие для врачей №УМО-17-28/248 от 12.07.2011 М. – 2011. – С. 52

7.Automated real-time nucleic acid amplification technology for rapid and simultaneous detection of tuberculosis and rifampicin resistance. Xpert MTB/RIF system. Policy statement. WHO/HTM/TB/2011.4

8.Laboratory Services in Tuberculosis Control. Parts I–III. – Geneva, WHO, 1998.

9.Rapid implementation of the Xpert MTB/RIF diagnostic test. Technical and operational “How to” Practical considerations. WHO/HTM/TB/2011.2

Материально-техническое обеспечение

Мультимедийная или проекционная демонстрационная системы, экран, лазерная указка; набор тематических слайдов.

Тема 7.2. «Геномная организация микобактерий туберкулезного комплекса»

Количество аудиторных часов – 1

Примерный план лекции

Основные вопросы, освещаемые в лекции:

•структура генома микобактерий туберкулеза;

•классификация генов;

•основные пути метаболизма

Вводная часть (5–10 мин)

Микобактерии туберкулезного комплекса (МБТК) – группа из 7-ми близко родственных видов: M.tuberculosis, M.africanum, M.microti, M.bovis, M.canettii, M.pinnipedii, M.caprae. Эти виды микобактерий отличаются друг от друга по патогенности, географическому распространению, некоторым физиологическим свойствам, таким как морфология колоний, чувствительность к антимикробным препаратам, эпидемиология и спектр хозяев. Однако геномы МБТК чрезвычайно сходны и аллельный полиморфизм между видами встречается с частотой 1 на 10.000 пар оснований. Поэтому результаты расшифровки генома представителя одного из видов МБТК можно с большой долей вероятности экстраполировать на других представителей.

Для изучения особенностей строения генома МБТК был выбран штамм M.tuberculosis H37Rv. Причиной выбора послужило то, что данный штамм представлен во всех мировых коллекциях и широко применяется в биомедицинских исследованиях туберкулёза. Он сохраняет вирулентность в моделях туберкулёза на животных и чувствителен к противотуберкулёзным препаратам. Полностью геномная последовательность лабораторного штамма M.tuberculosis H37Rv была определена и охарактеризована в 1998 г.

Основная часть (30 мин)

Геном M.tuberculosis H37Rv состоит из 4 411 529 пар оснований и содержит более 4000 генов. Геном богат гуанином (G) и цитозином (С) (65,6%). Содержание G и С в геноме относительно постоянно, однако было обнаружено несколько областей с более высоким, по сравнению со средним, содержанием. Эти области относятся к большому семейству генов, содержащему полиморфные последовательности, богатые гуанином и цитозином (polymorphic G+C rich sequences, PGRSs).

РАЗДЕЛ 1. Лекционные материалы

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Коренным отличием M.tuberculosis от других бактерий является то, что значительная часть кодирующей ёмкости генома направлена на производство ферментов липогенеза и липолиза, а также двух совершенно новых, ранее не известных семейств белков, богатых глицином и характеризующихся наличием повторяющихся структур, которые могут представлять собой источник определённой антигенной изменчивости. Кроме того, геном богат повторяющимися последовательностями ДНК, особенно IS-элементами (insertion sequences – вставочные последовательности), новыми мультигенными семействами и множественными копиями генов «домашнего хозяйства».

Далее преподаватель знакомит слушателей с картой генома

M.tuberculosis H37Rv (рис. 1).

На внешнем круге карты генома показан масштаб в млн. пар оснований; 0 – точка начала репликации.

На первом (снаружи) круге указаны позиции генов стабильных молекул РНК (гены тРНК отмечены голубым, гены других РНК – розовым цветом) и область прямых повторов (розовый куб). Всего в геноме обнаружено 50 генов, кодирующих функциональные молекулы РНК. Отличительной чертой микобактерий туберкулеза, по сравнению с другими микроорганизмами является то, что оперон рРНК (rrn) представлен в единичном экземпляре и располагается необычно далеко, на расстоянии примерно 1500 т.п.о., от точки начала репликации oriC, тогда как большинство эубактерий имеет один или более оперонов rrn рядом с точкой oriC. По всей видимости, такая организация данного оперона является одной из причин медленного роста M.tuberculosis.

На втором круге указаны цепи кодирующей последовательности ДНК (тёмно-зелёным отмечена цепь, транскрипция генов с которой идёт по часовой стрелке, светло-зелёным – цепь, транскрипция генов с которой идёт против часовой стрелки). На третьем круге указаны повторяющиеся последовательности ДНК (оранжевым цветом отмечены вставочные последовательности (IS-эле- менты), тёмно-розовым – 13Е12REP-семейство, голубым – профаги). Вставочные последовательности – это мобильные элементы, способные перемещаться из одного участка генома в другой. В геноме M.tuberculosis H37Rv обнаружен целый набор IS-элементов: 16 копий IS6110 и 6 копий IS1081. Также выявлены не описанные ранее 26 элементов семейств IS5 и IS256 и новое семейство повторяющихся последовательностей 13Е12, которое проявляет некоторые свойства мобильных генетических элементов. В

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

2)Гены биосинтеза аминокислот, например, LeuD, TrpD, ProC

ипуринов, например, PurC.

3)Гены потребления металлов, например, кодирующие белки транспорта и метаболизма ионов железа и магния MgtC, MbtB, IdeR.

4)Гены анаэробного дыхания и окислительного стресса, кодирующие нитрат-редуктазу, KatG, AphC, SodA, SodC.

3. Группа генов, кодирующих белки – регуляторы транскрипции, такие как

1)Сигма-факторы, которые позволяют осуществлять транскрипцию генов, в зависимости от условий окружающей среды (SigmaA, Sigma F, Sigma E, Sigma H);

2)Регуляторы ответа – белки (PhoP, PrrA, Rv0981), регулирующие транскрипцию определенного гена, входящие в состав сигнальной трансдукционной цепи, как правило, двухкомпонентной. Первый компонент этой цепи – рецепторный белок гистидин-ки- наза, который улавливает сигналы окружающей среды и передает их второму компоненту цепи – белку-регулятору, отвечающему за регуляцию транскрипции определенных генов.

3)Регуляторы транскрипции – белки (HspR, WhiB3 и RelA), контролирующие экспрессию большой группы генов.

Разнообразие метаболических путей

M.tuberculosis может синтезировать все незаменимые аминокислоты, витамины и кофакторы, перерабатывать разнообразные органические соединения. В избытке присутствуют системы метаболизма липидов, равно как и все ферменты, необходимые для гликолиза, пентозофосфатного пути, а также цикла трикарбоновых кислот и глиоксилатного цикла. Было предсказано большое число оксидоредуктаз, оксигеназ и дегидрогеназ, а также множество оксигеназ, содержащих цитохром Р450. Представлены также компоненты некоторых анаэробных фосфорилирующих цепей переноса электронов (гены нитратредуктазы, фумаратредуктазы и, возможно, нитритредуктазы). Два гена кодируют гемоглобин-по- добные белки, которые могут защищать от окислительного стресса или участвовать в захвате кислорода.

Существующий набор метаболических путей отражает удивительную способность бактерии приспосабливать свой метаболизм к изменениям окружающей среды, что помогает ей не только конкурировать с клетками лёгкого за кислород, но и адаптироваться к микроаэрофильным/анаэробным условиям в самом центре развивающейся гранулёмы.

Особое внимание при обсуждении метаболических особенностей M.tuberculosis следует уделить метаболизму липидов, так как лишь очень немногие организмы образуют такой разнообразный набор липофильных молекул, как туберкулёзная бацилла. В их числе можно назвать и простые жирные кислоты (пальмитат, туберкулостеарат), и изопреноиды, и очень сложные длинноцепочечные миколовые кислоты (главные липидные компоненты микобактериальной клеточной стенки) и фенолфтиоцероловые спирты (образуют сложные эфиры с микоцерозовой кислотой, создавая костяк для прикрепления микозидов). Микобактерии содержат примеры любой известной системы биосинтеза липидов и поликетидов, включая ферменты, обычно обнаруживаемые у млекопитающих и растений.

Однако даже такое разнообразие систем биосинтеза не может сравниться с уникальным спектром систем расщепления, например, систем окисления жирных кислот. Микобактерии, растущие in vivo, являются скорее липолитическими, чем липообразующими просто из-за количества и доступности липидов внутри клетки млекопитающего, поэтому наличие стольких систем расщепления вполне естественно. Примечательно, что у M.tuberculosis имеется примерно 250 различных ферментов метаболизма жирных кислот по сравнению с 50 у Е coli.

Следует отметить также другую метаболическую систему, важнейшую для выживания M.tuberculosis в организме хозяина, – систему синтеза сидерофоров – хелаторов, способных связывать и переносить ионы двухвалентного железа. Сидерофоры (у M.tuberculosis – микобактины и экзохелины) представляют собой структурно родственные молекулы. Они синтезируются не на рибосомах, а образуются в результате ферментативного внутриклеточного синтеза. Оперон mbt – единственная нерибосомальная пептидсинтезирующая система M.tuberculosis – ответственен за биосинтез обоих типов микобактериальных сидерофоров.

Заключительная часть (5 мин)

Подводя итог, обращается внимание слушателей, что геном представителей микобактерий туберкулезного комплекса крайне консервативен и мало отличается между видами. Расшифровка генома позволила описать гены микобактерий и сделала доступным понимание уникальной приспособляемости этого возбудителя к условиям внешней среды, которая достигается благодаря разнообразию метаболических путей. Знания о структурной организации

РАЗДЕЛ 1. Лекционные материалы

Тема 7.5. «Особенности генетики НТМБ»

Количество аудиторных часов – 1

Примерный план лекции

Основные вопросы, освещаемые в лекции:

•Общие сведения о геноме НТМБ

•Вставочные последовательности

•Плазмиды НТМБ

•Видоспецифические различия в геноме НТМБ

Вводная часть (5–10 мин)

Род Mycobacterium включает в себя большое количество видов, на сегодня их известно более 100. Хорошо известны микобактерии туберкулезного комплекса и отдельная ветвь рода – M.leprae. Остальные микобактерии широко распространены в окружающей среде как сапрофиты, а в некоторых случаях могут быть этиологическими факторами тяжелой (вплоть до смертельной) патологии

– это нетуберкулезные микобактерии (НТМБ), не входящие в туберкулезный комплекс.

Все еще актуальной остается классификация по E.Ranyon, включающая 4 основные группы, различающие НТМБ по скорости роста, морфологии колоний и способности к пигментообразованию.

Группы 1,2 3 – это медленно растущие микобактерии, требующие для роста колоний примерно столько же времени, сколько необходимо для получения культуры МБТ. Далее их дифференцируют по способности продуцировать желтый пигмент:

1)фотохромогены (образующие пигмент на свету), например,

M.kansasii, M.marinum, M.simiae;

2)скотохромогены (не требующие для образования пигмента свет), например, M.gordonae, M.szulgai, M.scrofulaceum;

3)нефотохромогены (не образующие пигмент), например, комплекс M.avium, M.xenopi, M.malmoense;

Микроорганизмы 4-ой группы – быстрорастущие (на обычных питательных средах – примерно в течение 7 дней), например,

M. chelonae, M.abscessus, M.fortuitum.

Основная часть (30 мин)

В настоящее время, согласно базы данных геномов BLAST, секвенированы или находятся в процессе секвенирования геномы 26 видов НТМБ, из которых наибольшее клиническое значение

РАЗДЕЛ 1. Лекционные материалы

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

имеют M.abscessus, M.chelonae, M.avium, М.intracellulare, M.marinum, M.ulcerans, М.xenopi и M.kansasii, также расшифрован геном и широко используемого в лабораторных исследованиях вида М. smegmatis.

Как и у микобактерий туберкулезного комплекса, геном НТМБ представлен кольцевой хромосомой с высоким содержанием гуанина и цитозина. Самый большой размер генома описан для М. smegmatis и состоит из 6,99 млн.п.о.

Особенности геномной организации НТМБ имеют свои особенности по сравнению с другими бактериями, а также по сравнению с микобактериями туберкулезного комплекса. От других бактерий их отличает низкое число копий генов рРНК, от микобактерий туберкулезного комплекса – наличие у многих видов плазмид. Кроме того, для ряда видов НТМБ характерно наличие видоспецифических мобильных элементов.

В отличие от многих других видов бактерий, которые имеют множественные копии генов рРНК (например, E.coli –7, а Streptomyces lividans – 6), у микобактерий выявлено малое число копий этого гена. Медленнорастущие виды, такие как M.avium, M. paratuberculosis, М.intracellulare, M.simiae и M.marinum, также как и M.tuberculosis и M.leprae, обладают только одной копией генов, кодирующих 16S, 23S и 5S рРНК. Большинство быстро растущих видов имеют 2 копии генов, за исключением M.chelonae и M.abscessus, у которых найдена только одна копия. Так как существует взаимосвязь между числом рибосом в клетках и уровнем синтеза белков, возможно, что низкое число генов рРНК ограничивает уровень синтеза белков, следовательно, и скорость роста у медленно растущих микобактерий.

Ген, кодирующий субъединицу 16S рРНК, часто используют для видового типирования НТМБ, т.к. его последовательность уникальна для каждого вида микобактерий. По своему строению этот ген содержит как консервативный регион, так и вариабельный, специфичный для каждого вида микобактерий, что делает его удобной мишенью для видовой идентификации. Удобство применения этого гена в качестве мишени заключается в том, что в базе геномов GeneBank его последовательности для разных видов микобактерий представлены наиболее полно по сравнению с другими генами микобактериального генома.

У ряда видов НТМБ были обнаружены внехромосомные генетические элементы – плазмиды. Плазмиды широко распространены среди членов группы M.avium, M. intracellulare и M. scrofulacerum, а также у M.fortuitum. В некоторых штаммах плазмидная

ДНК составляет почти 30% от тотальной ДНК, довольно стабильна, особенно среди медленно растущих видов.

В ряде работ было установлено, что у M.avium и M.scrofulaceum плазмиды кодируют устойчивость к ртути и меди, а также отвечают за рестрикции и модификации. Плазмиды наиболее часто встречались у членов комплекса M.avium, выделенных от больных СПИДом, в отличие от штаммов, выделенных от ВИЧ-негативных больных и из окружающей среды. Существует предположение, что плазмиды кодируют некоторые вирулентные особенности НТМБ комплекса M.avium, однако исследования, подтверждающие это, проведены пока не были.

Установленная для изолятов M.chelonae способность к деградации морфолина, также закодирована в плазмидной ДНК.

К сожалению, на сегодняшний день довольно мало известно о наличии плазмид у большинства видов НТМБ, т.к. планомерных исследований по этой проблеме не проводилось. Кроме того, пока не проведена идентификация генов, кодируемых плазмидами.

У нетуберкулезных микобактерий был обнаружен ряд специфических мобильных генетических элементов. Устойчивость к сульфониламидам у M.fortuitum возникает вследствие наличия мобильных генетических элементов.

Устойчивость к тетрациклину M.peregrinum и у трети биовариантов M.fortuitum возникает вследствие наличия генов tetK и tetL, которые у других бактерий обычно ассоциируются с мобильными генетическими элементами.

Было показано, что наличие уникальной IS901 в штаммах комплекса M.avium ассоциируется с повышенной вирулентностью возбудителя в модели заражения мышей.

Уникальные для штаммов мобильные элементы часто используют как маркер в эпидемиологических исследованиях, например IS900 – для M.paratuberculosis, IS901 – для всего комплекса

M. avium, IS2404 – для M.ulcerance. Молекулярно-эпидемиологические исследования НТМБ ин-

тенсивно развиваются в последнее время. Для использования какой-либо последовательности генома в качестве генетического маркера, она должна отвечать следующим критериям:

1)стабильность последовательности;

2)присутствие во всех изолятах;

3)наличие достаточного числа альтернативных форм, благодаря чему достигается высокий уровень дискриминации между штаммами.

РАЗДЕЛ 1. Лекционные материалы