6 курс / Клинические и лабораторные анализы / Лабораторная_диагностика_туберкулеза_Ерохин_В_В_ред_

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

вании и закрывании дверей комнаты, при неудачном распределении поступающего в помещение воздуха. В связи с этим, место установки ШББ должно быть отдаленно от входа в рабочую комнату, располагаться в стороне от проходов (движение воздуха от проходящих мимо людей может нарушать «воздушный замок» в ШБб). Этот «замок» весьма подвижный, в связи с чем, открытые окна или оборудование, создающее движение воздуха (к примеру, двигатели, охлаждающие центрифуги и морозильные камеры), не следует располагать вблизи ШББ.

Следует придерживаться правил работы со шкафами биологической безопасности I и II классов определяют следующий минимум практических рекомендаций.

Вытяжные шкафы специализированные

Основным назначением вытяжного шкафа (ВШ) является его механическая способность к устранению вредных испарений непосредственно с настольной (рабочей) зоны, на которой проводятся лабораторные процедуры, включающие использование вредных веществ. В БЛ ПТУ к таким относятся фенол, неорганические кислоты, красители. Вытяжной шкаф не позволяет вредным, химическим соединениям распространяться в помещениях. В вытяжных шкафах производится окраска препаратов для микроскопии и их подсушивание после окрашивания, а также другие манипуляции, например, приготовление реактивов.

Скорость потока воздуха в вытяжных шкафах не нормируется по параметрам биологической безопасности и ламинарности движения. В связи с этим, использование вытяжных шкафов вместо ШББ категорически недопустимо, так как ВШ не обеспечивают своевременное удаление инфекционных аэрозолей и способствуют кросс-контаминации исследуемых образцов.

Включение и работа ВШ не должны нарушать работы других вентиляционных систем лаборатории. Для корректной работы всех вентиляционных систем помещений предпочтительно использовать ВШ, в которых предусмотрен клапан обратного тока воздуха, который перекрывает воздуховод при выключении шкафа и исключает перетоки воздуха между другими системами локальной вентиляции и помещениями.

Вытяжные зонты

В БЛ допускается над ШББ, центрифугами и другими особо опасными зонами устройство вытяжных зонтов (колпаков), которые предназначены для активного удаления воздуха из района рабочей зоны.

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

•по окончании работы, все объекты, содержащие ПБА, должны быть помещены в хранилища (термостаты, холодильники, шкафы и пр.);

•контаминированные микобактериями отработанные материалы, лабораторную посуду, твердые отходы и пр. из «заразной» зоны помещают в специальные упаковочные мешки для автоклавирования, биксы или металлические баки с крышками и подвергают автоклавированию (126°С – 60 мин) или дезинфицируют химическими средствами на местах;

•жидкие отходы перед сбросом в канализационную систему подлежат обязательному химическому или термическому обеззараживанию;

•руки следует мыть специальным бактерицидным мылом или обработать кожным антисептиком сразу после работы с потенциально инфицированной лабораторной посудой, после всех микробиологических процедур, снятия защитной одежды, а также перед тем, как покинуть помещение лаборатории. Для вытирания рук после мытья следует пользоваться одноразовыми бумажными полотенцами. Запрещается использовать «воздушные полотенца»;

•одежду персонала (халаты, шапочки) замачивают в растворе дезинфицирующего средства, и после экспозиции стирают, прополаскивают, высушивают. Возможно обеззараживание одежды в процессе стирки в стиральных машинах при использовании в них высокой температуры или дезинфицирующего средства, разрешенного для этих целей, или автоклавирование;

•в рабочих помещениях лаборатории запрещается принимать пищу, пить, курить, применять косметические средства.

Заключительная часть (5 мин)

Следует подчеркнуть, что эффективная работа инженерных мер защиты и дезинфекционных мероприятий может быть достигнута лишь при правильном выполнении всех предписаний сотрудниками лаборатории. Система вентиляции воздуха в рабочих помещениях должна предотвращать распространение инфекционного аэрозоля за пределы помещения при любых режимах работы.

Рекомендуемая литература

1.Приказ МЗ РФ № 109 от 21 марта 2003 г. «О совершенствовании противотуберкулезных мероприятий в Российской Федерации.

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

МОДУЛЬ 7. Гены микобактерий и микобактерий туберкулезного комплекса

Тема 7.1. «Введение. Актуальность использования молекулярногенетических методов исследования во фтизиатрии»

Количество аудиторных часов – 1

Примерный план лекции

Основные вопросы, освещаемые в лекции:

•Особенности эпидемиологических показателей по туберкулезу в РФ на современном этапе, проблема повышения выявления ЛУ МБТ;

•Сокращение сроков микробиологической диагностики туберкулеза;

•Совершенствование идентификации микобактерий до вида и штамма.

Вводная часть (5–10 минут)

Туберкулез в Российской Федерации представляет собой большую медико-социальную проблему. Статистический анализ заболеваемости ТБ в 2011 г. выявил 73 новых случая заболевания туберкулезом на 100 000 населения. Смертность от ТБ была зафиксирована у 14,2 на 100 000 населения.

В условиях напряженной эпидемиологической ситуации по туберкулезу в РФ особенно остро стоит проблема модернизации фтизиатрии, которая должна быть направлена на повышение эффективности лечения туберкулеза, совершенствование эпидемиологических исследований и изучение биологических свойств эпидемически значимых групп МБТ.

Основная часть (30 мин)

Использование молекулярных методов позволило по-новому взглянуть на эпидемиологию туберкулеза и оценить генетическое разнообразие штаммов микобактерий, циркулирующих в РФ. Применение методов молекулярной эпидемиологии дало возможность описать штаммы, преимущественно циркулирующие в данной местности, определить пути их передачи и проводить эпидемиологические расследования в клинической практике.

Повышение эффективности лечения основано на ускорении постановки диагноза и своевременной коррекции схем химиотерапии.

Наиболее быстрый классический метод выявления МБТ – микроскопия, позволяет в течение 1–2 дней выявить МБТ в мазке мокроты, однако с крайне низкой чувствительностью. Более чувствительные культуральные исследования на плотных питатель-

ных средах занимают от 3–10 недель, после чего проводится постановка тестов на лекарственную чувствительность, которые длятся еще 3–4 недели. В целом весь процесс диагностики ТБ с определением лекарственной чувствительности занимает от 6 до

14недель.

Внастоящее время в лабораторной практике все более широкое применение находят молекулярно-генетические методы, которые позволяют сокращать сроки выявления возбудителя, видовой идентификации микобактерий и определения лекарственной чувствительности.

Для выявления возбудителя широко используется метод ПЦР, основанный на выявлении в геноме микобактерий видоспецифических последовательностей. Метод зарекомендовал себя как высоко специфичный и чувствительный. Предпочтительными являются тест-системы с детекцией результата в режиме реального времени. Получение положительного результата методом ПЦР позволяет в течение 1–2 дней установить наличие МБТ в диагностическом материале. Внедрение ПЦР позволило значительно сократить сроки подтверждения диагноза туберкулеза. Получение положительного результата методом ПЦР не требует дополнительной дифференциации МБТК от НТМБ, т.к. положительный результат однозначно указывает на принадлежность к МБТК. ДНК, выделенная из диагностического материала и использованная для проведения ПЦР, может быть использована для установления ЛУ существующими молекулярно-генетическими тест-системами.

Определение лекарственной чувствительности

ТБ с МЛУ представляет собой сложнейшую проблему с точки зрения борьбы с туберкулезом. В РФ наблюдается крайне высокий уровень распространения штаммов с МЛУ с его неуклонным нарастанием. В 2011 году отмечено 15,5% случаев МЛУ туберкулеза среди новых случаев заболевания туберкулезом, и 34,2% среди ранее леченых.

Вызывающая тревогу динамика роста МЛУ-ТБ, появление туберкулеза с широкой лекарственной устойчивостью (ШЛУ-Тб), потенциальная передача инфекции внутри лечебных учреждений и резкий подъем смертности среди ВИЧ-инфицированных больных с МЛУ-ТБ и ШЛУ-ТБ – все эти обстоятельства привели к неотложной необходимости приступить к внедрению экспресс-ме- тодов скрининга.

Традиционные методы культуральных исследований в области микобактериологии и определения лекарственной чувствительности занимают много времени и трудоемки, требуют соблюдения определенной последовательности процедур для выделения мико-

РАЗДЕЛ 1. Лекционные материалы

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

бактерий из клинического материала и связаны с идентификацией микобактерий комплекса M.tuberculosis.

За это время пациенты могут проходить неадекватный курс лечения, может продолжаться циркуляция лекарственно-устойчи- вых штаммов и происходить усиление резистентности. Новые технологии для быстрого выявления устойчивости к ПТП стали, таким образом, одной из приоритетных задач в области научных исследований и разработок по проблеме ТБ, и в этом плане наиболее продвинутыми для ускоренного обнаружения устойчивости к рифампицину (только к нему или в сочетании с изониазидом) оказались молекулярно-генетические методы.

Основным достоинством всех молекулярно-генетических методов тестирования ЛУ МБТ является быстрота получения результатов и оперативное выявление больных МЛУ-туберкулезом, так как все указанные тест-системы позволяют выявить ЛУ к рифампицину, которая считается маркером МЛУ. Генотипические методы имеют много важных преимуществ для совершенствования контроля за лекарственно-устойчивым ТБ, особенно в том, что касается скорости получения результата, стандартизации тестов, возможности для высокой производительности и сниженной необходимости в соблюдении биобезопасности. Конечной целью выполнения молекулярных анализов является быстрая первичная идентификация МЛУ ТБ.

Применение молекулярно-генетических тест-систем позволяет проводить определение лекарственной чувствительности МБТ непосредственно из диагностического материала. В этом случае получение результата о наличии у больного МЛУ ТБ возможно через 1–2 дня после поступления материала.

Молекулярно-генетические тест-системы на определение ЛУ представлены четырьмя основными вариантами: биологические микрочипы, ПЦР в режиме реального времени, ДНК-стриповая технология, набор Xpert MTB/RIF.

Наличие ПЦР тест-систем, определяющих в течение 1–2 дней устойчивость к основным ПТП, позволяет разделить потоки больных с МЛУ и не-МЛУ туберкулезом, направить их в МЛУ-центр, где имеется возможность изоляции больного и назначения химиотерапии резервными препаратами.

Определить устойчивость к изониазиду и рифампицину позволяют как отечественные тест-системы "ТБ-биочип" (ООО «БИОЧИП», Россия), в основе которой лежит технология биологических микрочипов, набор реагентов для проведения ПЦР в режиме реального времени (ЗАО "Синтол"), так и зарубежные, такие как

набор GenoType® MTBDRplus (HAIN Lifescience, Германия), представляющий собой ДНК-стриповую технологию, основанную на множественной обратной гибридизации (позволяет определять ЛУ МБТ к рифампицину и изониазиду).

Отдельно стоит упомянуть тест, выполняемый с помощью набора реагентов Xpert MTB/RIF на анализаторе GeneXpert, который позволяет в течение 2–3 часов выявить наличие в мокроте МБТ и определить их устойчивость к рифампицину. Использование этой системы позволяет непосредственно из нативной мокроты в очень короткие сроки, в один этап выявлять возбудителя, определять принадлежность к МБТК и определять лекарственную чувствительность (к рифампицину). Чувствительность метода как по выявлению, так и по установлению лекарственной чувствительности не уступает системе BACTEC MGIT960 и культуральным исследованиям на плотных питательных средах.

Для установления ЛЧ молекулярно-генетическими методами

кболее широкому спектру препаратов применяются тест-системы "ТБ-биочип-2" (ООО "Биочип"), позволяющую определять на микрочипе чувствительность к фторхинолонам, и "GenoType® MTBDRsl" (HAIN Lifescience, Германия), основанную на технологии ДНК-стрипов и позволяющую определять устойчивость к фторхинолонам, этамбутолу, аминогликозидам.

Последний, несмотря на довольно низкую чувствительность при установлении устойчивости к этамбутолу и аминогликозидам / капреомицину, позволяет получать ориентировочные сведения о чувствительности МБТ и является на сегодняшний день тест-си- стемой, позволяющей проводить одновременное тестирование ЛУ

кнаибольшему числу ПТП.

Однако, применение молекулярно-генетических методов в настоящее время не устраняет необходимости проведения традиционных культуральных методов, т.к. иногда в диагностическом материале оказывается недостаточное количество МБТ. Поэтому определение ЛУ возможно после культивирования на питательных средах. Кроме того, современные молекулярно-генетические методы определения ЛУ охватывают гораздо меньший спектр ПТП, чем культуральные методы.

При росте числа больных, инфицированных НТМБ, большое значение имеют молекулярно-генетические тест-системы для видовой идентификации микобактерий. В случае ускоренной диагностики туберкулеза видовая идентификация является актуальной для быстрых культуральных методов, таких, как ВАСТЕС MGIT 960. Нетуберкулезные микобактерии резистентны к большинству

РАЗДЕЛ 1. Лекционные материалы