6 курс / Клинические и лабораторные анализы / Лабораторная_диагностика_туберкулеза_Ерохин_В_В_ред_

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

агностического материала), однако для данной категории пациентов, которым уже назначена адекватная химиотерапия, время получения результатов ЛЧ не столь критично.

Эффективность лечения туберкулеза по результатам ускоренного определения лекарственной чувствительности МБТ молекулярно-ге- нетическими методами. В настоящее время химиотерапия туберкулеза требует пересмотра подходов. Эмпирическое лечение при неизвестной лекарственной устойчивости микобактерий зачастую грозит не только снижением эффективности курса терапии, но и развитием дополнительной резистентности к ранее действенным препаратам, и как следствие, формированием хронических бациллярных форм туберкулеза. Химиотерапию следует проводить только при известном спектре лекарственной устойчивости возбудителя, выделенного от больного. Очевиден и тот факт, что быстрое назначение адекватного лечения резко повышает шансы больного туберкулезом на выздоровление. В этих условиях особое значение приобретает доступное, качественное и быстрое определение лекарственной чувствительности МБТ.

В противотуберкулезных учреждениях, где не используются ускоренные методы выявления и определения ЛЧ врач вынужден выбирать схему химиотерапии, руководствуясь такими критериями, как категория больного (если впервые выявленный, то туберкулез чувствительный) или наличие контактов пациента с больным туберкулезом родственником. Больной 2–3 месяца вынужден получать химиотерапию, которая может оказаться неадекватной. Коррекцию химиотерапии врач сможет провести только после получения результатов выявления микобактерий и постановки теста на ЛЧ на плотных средах. При использовании ускоренных методов определения ЛЧ врач может сразу же назначить правильное лечение.

Проведенные исследования показали, что ранняя коррекция курса химиотерапии по результатам молекулярно-генетических тестов определения ЛЧ у больных с выявленным МЛУ-туберкулезом привела к быстрому (в течение 6 месяцев лечения) абациллированию мокроты и заживлению полостей распада, тогда как у больных, которым схема химиотерапии корректировалась позже по данным классических методов определения ЛЧ, в эти же сроки продолжалось бактериовыделение и инволюция воспалительнодеструктивных изменений в легких была замедленной.

Заключительная часть (5 мин)

Использование ускоренных методов микробиологической диагностики туберкулеза позволяет на этапе обследования больного при поступлении в стационар выявлять устойчивость МБТ к ПТП и назначать адекватный режим химиотерапии в интенсивную фазу лечения, что сокращает сроки абациллирования, повышает эффективность лечения и предотвращает распространение лекарст- венно-устойчивых штаммов M.tuberculosis.

Рекомендуемая литература

1.Бастиан И., Порталс Ф. Туберкулез с множественной лекарственной устойчивостью. – М.: Медицина и жизнь, 2003.

2.Васильева И.А., Черноусова Л.Н., Заседателев А.С., Соболев А.Ю., Михайлович В.М. Клиническое значение микрочиповой технологии определения лекарственной устойчивости микобактерий туберкулеза // Проблемы туберкулеза. – 2002 – № 6 – С. 21–24.

3.Исакова Ж.Т. Практическое значение тест-системы «ТБ-био- чип MDR» в экспресс-идентификации штаммов М. tuberculosis с множественной лекарственной устойчивостью // Клиническая лабораторная диагностика. – 2009. – № 2. – С. 50–51.

4.Кузьмин А.В., Васильева И.А., Черноусова Л.Н. Эффективность химиотерапии деструктивного туберкулеза легких, основанной на результатах экспресс-детекции лекарственной чувствительности к изониазиду и рифампицину тест-системой – «ТБ-БИО- ЧИП»// Проблемы туберкулеза и болезней легких. – 2006. – №8. – С. 17–23.

5.Hillemann D., Rusch-Gerdes S., Richter E. Evaluation of the GenoType MTBDRplus Assay for Rifampin and Isoniazid Susceptibility Testing of Mycobacterium tuberculosis Strains and Clinical Specimens// J Clin Microbiol. – 2007. – № 45(8). – Р. 2635–2640.

6.Mitchinson D.A., Nunn A.J. Influence of initial drug resistance on the response to short-course chemotherapy of pulmonary tuberculosis// Am Rev Respir Dis. – 1986. – № 133. – Р. 423–430.

7.Rossman M.D., MacGregor R.R. Tuberculosis: clinical management and new challenges // McGraw Hill Inc., New York, 1995.

Материально-техническое обеспечение

Мультимедийная или проекционная демонстрационная системы, экран, лазерная указка; набор тематических слайдов.

РАЗДЕЛ 1. Лекционные материалы

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Модуль 12. Организация лаборатории молекулярногенетических методов исследований

Тема 12.1. «Задачи лаборатории молекулярно-генетических методов исследований»

Количество аудиторных часов – 1

Примерный план лекции

Основные вопросы, освещаемые в лекции:

•Важность обеспечения комплексных микробиологических и молекулярно-генетических исследований, согласно алгоритму лабораторной диагностики туберкулеза и микобактериальных инфекций.

•Обеспечение качества исследований в лабораториях, применяющих молекулярно-генетические методы диагностики.

•Ускоренное выявление МБТ и НТМБ

•Сокращение сроков определения ЛУ

•Точная видовая и штаммовая идентификация микобактерий

Вводная часть (5–10 мин)

Во введении рекомендуется сформировать представление о том, что тесное взаимодействие всех структурных подразделений лабораторной службы направлено на скорейшее установление диагноза туберкулез, подтвержденного всеми возможными лабораторными методами молекулярно-генетической и микробиологической диагностики.

Всемирная Организация Здравоохранения разработала новую стратегию "Остановить ТБ". Ее целью является значительное уменьшение глобального бремени туберкулеза к 2015 году, путем обеспечения для всех категорий пациентов с туберкулезом всеобщего доступа к высококачественной диагностике и ориентированному на пациента лечению. Стратегия также поддерживает разработку новых и эффективных инструментов для профилактики, выявления и лечения туберкулеза.

В силу сложившихся эпидемиологических условий исследование биологического материала на наличие микобактерий является приоритетным направлением ранней диагностики туберкулеза и микобактериальных инфекций. Предпочтение должно отдаваться ускоренным методам выявления с применением современных мо- лекулярно-генетических и микробиологических технологий, обеспечивающих высокую чувствительность и специфичность исследований.

При туберкулезе и заболеваниях, вызванных нетуберкулезными микобактериями диагностика и лечение не должны представлять собой два отдельных подхода. Лечение должно быть основано на своевременном установлении спектра лекарственной чувствительности возбудителя в каждом конкретном случае туберкулеза или микобактериальной инфекции. Работа лаборатории должна способствовать максимальному решению поставленных задач.

Следует подчеркнуть, что залогом правильной организации лабораторной службы является объединение микробиологической и молекулярно-генетической диагностики в цельный взаимодополняющий комплекс. Кроме того, следует стремиться, чтобы на пути создания подобных комплексов было как можно меньше преград.

Организация комплексных исследований требует учитывать потребности каждого структурного подразделения в обеспечении специализированными помещениями, оборудованием и расходными материалами. Длительные исследования требуют от работников лаборатории постоянной, активной и планомерной работы с диагностическим материалом, основанной на комплексе взаимодополняющих методов.

РАЗДЕЛ 1. Лекционные материалы

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Основная часть (30 мин)

В основной части лекции рекомендуется развить представление о том, что тесное взаимодействие всех структурных подразделений лабораторной службы направлены на решение задач быстрого выявления и установления лекарственной чувствительности возбудителя туберкулеза и микобактериальных инфекций.

Кроме того, необходимо уделить внимание рассмотрению основных требований, применяемых к выбору тактики лабораторной диагностики, методам, призванным решить основные задачи диагностики туберкулеза и микобактериальных инфекций, мерам по организации лабораторий, использующих молекулярно-генетиче- ские методы, мерам по предотвращению контаминации и контролю качества лабораторных исследований.

Помощь пациентам начинается с качественной лабораторной диагностики, гарантированной исследованиями с высокой чувствительностью и специфичностью. Для постановки окончательного диагноза туберкулез и начала адекватного лечения необходимо выделить и идентифицировать M.tuberculosis и провести тесты для определения лекарственной чувствительности (ЛЧ). Методы лабораторной диагностики, применяемые для этих целей, в максимально короткие сроки должны давать ответ об индивидуальном спектре ЛЧ возбудителя.

Среди лабораторных исследований, используемых для диагностики микобактериальных инфекций, ускоренные микробиологические и молекулярно-генетические методы являются революционным направлением, наиболее динамично развивающимся в настоящее время. Их значение трудно переоценить, когда речь идет о характеристике возбудителя такого инфекционного заболевания как туберкулез.

Стратегия, основанная на комплексе ускоренных микробиологических и молекулярно-генетических методов, позволяет в течение короткого времени по результатам лекарственной чувствительности микобактерий подбирать индивидуальный режим химиотерапии. В результате повышается эффективность лечения, предотвращается распространение инфекции, сокращаются сроки пребывания больного в стационаре.

Координация работы микробиологических лабораторий всех ступеней может быть обеспечена использованием общих диагностических алгоритмов, учитывающих оснащенность и возможности лабораторий.

В лабораториях противотуберкулезной службы проводятся исследования с высокопатогенными микроорганизмами, персонал подвергается высокому риску заражения, в связи с этим, при выборе объема и перечня исследований необходимо учитывать мате- риально-технические возможности лаборатории, обеспечивающие соответствие методик качественному и безопасному выполнению анализов.

Культуральные методы играют ключевую роль в диагностике и используются для выполнения тестов на выявление возбудителя в диагностическом материале, его идентификации и проведения тестов на ЛЧ. Выделение микобактерий обеспечивает постановку точного диагноза туберкулеза или заболевания, вызванного нетуберкулезными микобактериями.

Использование жидких сред в системе ВАСТЕС MGIT 960 существенно сокращает время получения результатов и способствует стандартизации, обеспечивающей достоверность исследований.

Все положительные культуры должны быть исследованы для дифференциации МБТК от НТМБ и неспецифической микрофлоры перед постановкой теста на ЛЧ. Лаборатории, проводящие определение ЛЧ, должны, как минимум, дифференцировать МБТК от других микобактерий.

Современные методики, используемые для первичной дифференциации МБТК от НТМБ, включают иммунохроматографические тесты (определение фракции белка MPT64, специфичного для МБТК) и методы, основанные на ПЦР, в настоящее время являющиеся золотым стандартом для видовой идентификации НТМБ.

Применение современных молекулярно-генетических методов для диагностики туберкулеза и микобактериальных инфекций

Основными достоинствами молекулярно-генетических методов является высокая скорость проведения исследования (от 2 до 48 часов), высокая чувствительность при выявлении возбудителя в диагностическом материале (от 50 до 500 клеток МБТК в образце), высокая специфичность анализа (до 99%) и относительная дешевизна исследования.

Методы молекулярной диагностики в настоящее время позволяют:

В течение 1 дня с применением базового метода ПЦР – определять наличие в диагностическом материале микобактерий туберкулеза.

РАЗДЕЛ 1. Лекционные материалы

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Втечение 1–3х дней в зависимости от применяемой технологии (гибридизация, ПЦР в режиме реального времени) определять лекарственную чувствительность выявленного патогена к противотуберкулезным препаратам основного и резервного ряда.

Втечение 1–3х дней проводить идентификацию культуры микобактерий до вида.

Оптимальный комплекс исследований включает:

•выявление микобактерий методами люминесцентной микроскопии и/или молекулярно-генетическими методами

•выявление/исключение МЛУ ТБ-определение устойчивости к изониазиду и рифампицину молекулярно-генетическими методами

•исключение/подтверждение диагноза МЛУ или ШЛУ туберкулеза, определение спектра устойчивости к основным и резервным препаратам молекулярно-генетическими методами

•выделение культур на плотных и жидких средах

•подтверждение принадлежности выделенных культур к комплексу микобактерий туберкулеза молекулярно-генетическим и/или иммунологическим методами

•определение спектра лекарственной чувствительности на жидких средах с применением автоматических анализаторов к основным и резервным препаратам

•определение вида и лекарственной чувствительности НТМБ Молекулярные методы не исключают необходимость исполь-

зования общепринятых культуральных методов и методов фенотипического определения лекарственной устойчивости.

Молекулярно-генетические методы подходят для внедрения на уровне центральных региональных лабораторий с возможностями обеспечения необходимой инфраструктуры. В лабораториях более низкого уровня, не обеспеченных соответствующей лабораторной базой, возможно применение картриджной технологии, не требующей зонирования помещений.

Методом, на котором основана вся молекулярно-генетическая диагностика, направленная на выявление, идентификацию и определение ЛЧ возбудителя туберкулеза и микобактериозов, является полимеразная цепная реакция (ПЦР), в основе которой лежит амплификация специфического участка генома исследуемого патогена.

Метод ПЦР лежит в основе других молекулярно-генетических методик, использующих продукты амплификации нуклеиновых

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

–ПЦР для бактерий МБТК с дальнейшей гибридизацией на стриповых мембранах с целью дифференциации внутри МБТК из клинического материала и культур (выявление M.tuberculosis,

M.africanum, M.bovis, M.microti, M.canettii).

–ПЦР с дальнейшей гибридизацией на стриповых мембранах для определения и идентификации наиболее клинически значимых видов микобактерий: МТБК, НТМБ – M.avium, M.intracellulare, M.kansasii, M.malmoense.

–ПЦР с дальнейшей гибридизацией на стриповых мембранах для идентификации 31-го вида НТМБ из культур.

Необходимо учитывать, что успех любой тест-системы, использующей молекулярно-генетические методы для диагностики туберкулеза, в первую очередь, зависит от качества исследуемого материала и от того, каким методом производится выделение ДНК. Микобактерии относятся к группе внутриклеточных патогенов, имеющих трехслойную клеточную стенку с пептидогли- кано-арабиногалактановым комплексом с высоким содержанием (до 60%) липидов и восков, кроме того, биологические образцы могут содержать много компонентов, ингибирующих термостабильную ДНК-полимеразу. В связи с этим, для выделения ДНК из диагностического материала используются многостадийные методы выделения на основе сорбентов. Использование малоэффективных упрощенных методов не допускается. Одношаговые методы возможно использовать только для выделения ДНК из культур и положительных пробирок BACTEC MGIT 960.

Требования к организации работ

Исследование материала, содержащего или подозрительного на наличие бактерий рода Mycobacterium, связано с необходимостью одновременного обеспечения и соблюдения персоналом правил биологической безопасности и требований к организации

ипроведению работ с целью предотвращения контаминации нуклеиновыми кислотами и (или) ампликонами исследуемых проб помещений и оборудования.

Исследования проводятся в организациях, имеющих лицензию

исанитарно-эпидемиологическое заключение о возможности проведения данных работ, выданных в установленном порядке.

Контроль качества молекулярно-генетических исследований

В лаборатории, использующей молекулярно-генетические методы в диагностических целях, проводят внутрилабораторный контроль качества проводимых исследований с периодичностью,