6 курс / Клинические и лабораторные анализы / Лабораторная_диагностика_туберкулеза_Ерохин_В_В_ред_

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

По данным Определителя бактерий Bergey возбудитель туберкулеза относится к группе Микобактерии, содержащей единственный род Mycobacterium. В 1975 году род Mycobacterium включал в себя около 30 видов, а к 2000-му году это число уже приблизилось к 100.

Большинство видов микобактерий относятся к сапрофитным микроорганизмам, широко распространенным в окружающей среде. К роду микобактерий относится и возбудитель проказы –

M.leprae.

Впоследнее время значительно возросло число видов микобактерий, вызывающих заболевание человека и животных – микобактериозы. Как правило, это условно патогенные микроорганизмы, переход которых из категории сапрофитных к патогенным обусловлен распространением иммунодефицитных состояний среди людей.

В50-х годах на основании скорости роста и способности различных видов микобактерий к пигментообразованию была разработана система классификации микобактерий Раньона.

Группа I – Фотохромогенные медленнорастущие

К этой группе относят микобактерии, непигментированные при выращивании в темноте, но приобретавшие ярко-желтую или желто-оранжевую пигментацию после выдерживания на свету. Потенциально патогенные штаммы, относящиеся к этой группе:

M.asiaticum, M.kansasii, M.marinum, M.simiae. Среди микобактерий этой группы есть как быстрорастущие (например, M.marinum), так и медленно растущие (M.asiaticum, M.kansasii). Оптимальная температура роста варьирует от 25°С (M.simiae), 32–33°С (M.marinum) до 37°С (M.asiaticum).

Наибольшую клиническую значимость в России имеет вид

M.kansasii. Штамм M.kansasii (M.luciflavum) выделен и описан Булер и Поллак в 1953 г. как возбудитель заболеваний людей. На яичной среде растет в виде шероховатых или гладких колоний, температурный оптимум 37°С. Морфологически бактерии умеренной длины. Описаны 2 варианта M.kansasii: оранжевый (auranticum) и белый (album). Различия в способности образовывать фермент обусловлены возможностью вариантов образовывать В-каратиноиды. При введении морским свинкам микобактерии M.kansasii вызывают инфильтраты и уплотнения региональных лимфоузлов. M.kansasii встречается в водоемах.

Группа II – Скотохромогенные медленнорастущие

Название "Скотохромогенные" образовано от греческого слова "скотос" обозначающего "в темноте". К группе скотохромогенных бактерий относятся микобактерии, образующие пигмент в темноте. Скорость роста – 30–60 дней. В эту группу входят M.aquae

(M.gordonае) и M.scrofulaceum. M.scrofulaceum относится к потенциально патогенным видам. Впервые он был выделен и описан из гноя лимфатического узла ребенка с лимфаденитом. На яичной среде бактерии этого вида растут в виде оранжевого цвета гладких или шероховатых колоний. Морфологически они представлены короткими или длинными палочковидные формами. Растут при 25–37°С. Вызывают у детей поражения лимфоузлов и легких.

К сапрофитным скотохромогенным микобактериям относятся M.aquae (M.gordonae, Tab-water scotochromogen–скотохромогены водопроводной воды). На яичной среде растут в виде оранжевых колоний при 25–37°С. Морфологически – палочковидная форма умеренной длины (приблизительно 0,5 мкм). Обнаружены в водоемах.

Группа III – Нефотохромогенные медленнорастущие

К этой группе относятся микобактерии, не образующие пигмента или имеющие бледно-желтую окраску, которая не усиливается под воздействием света. Растут в течение 2–3-х или 5–6-ти недель. К ним относятся M.avium, M.xenopi, M.terrae, M.gastri, М.intracellulare, M.hattey, M.bruiiense.

M.avium (микобактерии птичьего типа) растут на среде Левен- штейна-Йенсена в виде пигментированных колоний при 37°С и 45°С. Бактерии этого вида – средней длины палочки. Патогенны для человека и ряда лабораторных животных, а также для домашних животных (например, свиней). Встречаются в воде, в почве.

M.xenopi. Выделен от жабы. Молодые культуры растут в виде непигментированных колоний; позднее появляется пигмент желтого цвета. Морфологически – длинные нитевидные палочки. Растут при 40–45°С, патогенны для человека.

M.terrae впервые были выделены из редьки. Растут на среде Ле- венштейна-Йенсена в виде беспигментных колоний. Оптимум роста 37°С. Морфологически представлены палочками умеренной длины, сапрофиты.

Группа IV – Быстрорастущие

Микобактерии, относящиеся к этой группе, характеризуются быстрым ростом – до 7–10 дней. Растут в виде пигментных или беспигментных колоний, чаще в виде R-формы. Хороший рост

РАЗДЕЛ 1. Лекционные материалы

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

дают в течение 2–5 дней при 25°С. К этой группе относятся потенциально патогенные микобактерии M.fortuitum, а также сапрофиты, такие как M.phlei, M.smegmatis и др.

M.fortuitum дает видимый рост на яичной среде на 2–4-й день в виде “розетки”. Морфологически представлен короткими палочками. На среде Левенштейна – Йенсена могут поглощать краску и окрашиваться в зеленый цвет. Штаммы вида M.fortuitum потенциально патогенны для человека. Широко распространены в природе.

Классификация по Раньону оказалась весьма удобной для проведения идентификации наиболее часто встречаемых видов микобактерий. Однако, с выявлением новых видов микобактерий и появлением все большего числа промежуточных форм, регистрация которых в той или иной подгруппе вызывает значительные затруднения.

В настоящее время, наряду с классификацией Раньона, используется разделение клинически значимых микобактерий на комплексы (табл.).

Основные клинически значимые комплексы микобактерий

Такая классификация позволяет объединить виды микобактерий одинаковой клинической значимости в большинстве тех случаев, когда более тонкая их характеристика до видов невозможна.

Для идентификации видов внутри комплекса M.tuberculosis, используются биологические, биохимические и молекулярные методы дифференциальной диагностики.

Нетуберкулезные микобактерии (НТМБ) передаются от человека человеку крайне редко. Частота выделения некоторых видов НТМБ из патологического материала от больных сопоставима с частотой выделения этих же видов из объектов внешней среды, что является косвенным подтверждением того, что передача этой группы видов микобактерий может происходить через живые и неживые объекты природы. В России первое место среди НТМБ за-

нимают M.avium complex (MAIS – M.avium, M.intracellulare, M.scrofulaceum) с некоторыми особенностями видовой распространенности. M.avium complex широко распространены во всем мире.

При сравнении ДНК этих микроорганизмов, выделенных на протяжении длительного времени в Бразилии и Англии, установлено, что штаммы от больных людей были идентичны друг другу и штаммам из объектов окружающей среды. Данное исследование подтвердило, что человек инфицируется из окружающей среды. По существующим данным, микобактерии M.avium complex являются одними из наиболее частых возбудителей микобактериозов у лиц, инфицированных ВИЧ.

Эпидемиологическое изучение источника и путей передачи инфекции выявило высокий процент содержания НТМБ в различных образцах почвы и воды. Установлено, что наиболее благоприятными условиями для обитания и размножения M.avium complex является теплая вода с заниженным значением рН, малым содержанием кислорода и высоким содержанием цинка.

Источником заражения человека НТМБ могут служить и сельскохозяйственные животные, птицы. Об этом говорят факты обнаружения возбудителей микобактериозов в молоке крупного рогатого скота и послеубойном материале.

Заключительная часть (5 мин)

Подводя итог, обращается внимание слушателей, на особенности микобактерий, характеризующие их группы и таксоны, и отличающие от других микроорганизмов. Обращается внимание слушателей на изменчивость микобактерий под воздействием ряда стресс-факторов для микроорганизмов. Проводится интерактивный опрос слушателей о свойствах микобактерий и их диагностических особенностях, экологии, среде обитания и трансмиссивности.

Рекомендуемая литература

1.Литвинов В.И., Макарова М.В., Краснова М.А. Нетуберкулезные микобактерии. – М.: МНПЦБТ, 2008. – 256 с.

2.Национальное руководство ФТИЗИАТРИЯ. Под общей ред. М.И. Перельмана. – М.: ГЕОТАР-Медиа, 2007. – 512 с.

3.Определитель бактерий Берджи. – М., "Мир", 9-е издание, 1997, т.2, С. 606–612

4.Оттен Т.Ф., Васильев А.В. Микобактериоз.– СПб: Медицинская пресса, 2005.–224 с.

5.Руководство по медицинской микробиологии. Частная медицинская микробиология и этиологическая диагностика инфек-

РАЗДЕЛ 1. Лекционные материалы

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Основная часть (30 мин)

Обнаружение кислотоустойчивых микобактерий (КУМ) в диагностическом материале методом прямой микроскопии применяют для выявления наиболее эпидемически опасных больных туберкулезом с целью своевременного оказания противоэпидемических мероприятий и прекращения трансмиссии возбудителя. Согласно Приказу МЗ РФ № 380 от 25.12.1997 г., микроскопическое исследование мокроты для выявления КУМ включено в перечень обязательных исследований, осуществляемых в КДЛ первичной медико-санитарной помощи ПМСП. Основные правила микроскопической диагностики материала от больных туберкулезом изложены в Приказе №109 от 21.03.2003 г. (Приложение №10). Необходимое качество микроскопических исследований обеспечивается введением системы внешнего и внутреннего контроля качества исследований, инспекционного контроля, лицензирования лабораторий, постоянного обучения специалистов лабораторий и т.д. Для преемственности учета случаев туберкулеза между ЛПУ различных ведомств и противотуберкулезной службой введены единые правила учета и отчетности для всех клинико-диагностических лабораторий (приказ МЗСР РФ №690 от 2.10.2006г.).

Принципы микроскопии кислотоустойчивых микобактерий

В КДЛ для обследования пациентов на КУМ используют метод прямой бактериоскопии, отличающийся тем, что:

1.обнаружение КУМ осуществляется непосредственно в нативном диагностическом материале;

2.микроскопическое исследование осуществляется с помощью световой в проходящем свете (или люминесцентной) микроскопии;

3.оценивается морфология и количество обнаруженных микроорганизмов; результаты исследования выражаются в полуколи-

чественных показателях.

МБТ, как и большинство МБ, имеют выраженную кислотоустойчивую окраску. Основной принцип микроскопического выявления МБ в препаратах основан на удержании клеткой красителей после обесцвечивания кислым спиртом или растворами неорганических кислот.

Количественная оценка и результаты исследования. При использовании объективов с увеличением 90–100 и окуляров 7–10 рекомендована полуколичественная оценка учета результатов световой иммерсионной микроскопии.

Параметры метода

Аналитическая чувствительность и специфичность световой микроскопии. Эти показатели зависят от метода микроскопии и техники ее исполнения.

Чувствительность и специфичность методов световой микроскопии при диагностике туберкулеза

* По данным территорий РФ, реализующих международные совместные проекты. ** По данным стран, реализующих проекты DOTS.

Диагностическая чувствительность и специфичность

Эти характеристики зависят от эпидемиологических особенностей территорий и локализации туберкулеза. При легочной локализации диагностическая чувствительность метода микроскопии зависит от качества материала (мокроты) и кратности исследований. Установлено, что результативность микроскопической диагностики легочного туберкулеза повышается следующим образом: при первичном исследовании одного (первого) препарата выявляется 78–83% бактериовыделителей, второго – на 10–14% больше и при исследовании третьего препарата – еще на 5–8% больше. Разница в диагностической чувствительности методов по российским и международным данным объясняется разными правилами постановки диагноза в программах DOTS и отечественной. В России учитываются данные лучевой диагностики, которая способна выявить специфические изменения в легких на ранних стадиях, когда бактериовыделение носит олигобациллярный характер или еще не наступило. При внелегочной локализации туберкулеза диагностическая чувствительность методов бактериоскопии составляют от 10% (мочеполовой туберкулез) до 20% (туберкулезные плевриты). Диагностическая специфичность при мочеполовом туберкулезе колеблется от 70 до 80%.

Микроскопическое исследование не позволяет дифференцировать МБ комплекса M.tuberculosis от НТМБ.

РАЗДЕЛ 1. Лекционные материалы

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Общие принципы люминесцентной микроскопии (ЛМ)

Люминесценция (от лат. lumen, род. падеж luminis – свет и -es- cent – суффикс, означающий слабое действие) – нетепловое свечение вещества, происходящее после поглощения им энергии возбуждения. С.И.Вавилов в 1948 году дал каноническое определение люминесценции: «Будем называть люминесценцией избыток над температурным излучением тела в том случае, если это избыточное− излучение обладает конечной длительностью примерно 10 10 секунд и больше». Это значит, что яркость люминесцирующего объекта в спектральном диапазоне волн его излучения существенно больше, чем яркость абсолютно чёрного тела в этом же спектральном диапазоне, имеющего ту же температуру, что и люминесцирующее тело.

Фотолюминесценция – это свечение объектов, возникающее в результате поглощенной ими лучистой энергии. Вследствие потери части энергии излучение люминесценции обладает большей длиной волны, чем поглощенное (правило Стокса). Поэтому люминесценцию выгодно возбуждать либо ультрафиолетовыми лучами (300–400 нм), либо сине-фиолетовыми. В обоих случаях возникает свечение в цветовом спектре всего или большей части видимого излучения. Спектр флюоресценции остается неизменным при любой длине волны возбуждающего излучения.

Фотолюминесценцию условно подразделяют на: флюоресценцию, то есть свечение со временем затухания, не превышающим 10–8 секунд; фосфоресценцию, которая продолжается более длительное время после прекращения возбуждения.

Флюорохромы – красители, не вызывающие сильной окраски объектов в обычном свете, но флюоресцирующие при облучении ультрафиолетовыми лучами. Из синтетических флюорохромов наилучшие результаты дают акридин оранжевый, корифосфин, примулин, родамин, ФИТЦ (флюоресцеинизотиоцианат), которые обычно применяют в виде слабых водных растворов. Для выявления кислотоустойчивых микобактерий применяют метод люминесцентной микроскопии, называемый флюорохромированием.

Зависимость спектров поглощения и излучения при люминесценции.

ЛМ основана на наблюдении светящихся микроскопических объектов на общем темном фоне препарата. По сравнению с методами световой микроскопии в проходящем свете, он обладает рядом преимуществ: высокая степень контрастности цветных светящихся объектов на темном фоне, значительно большая площадь поля зрения и др.

Суть ЛМ заключается в том, что объекты (клетки), окрашенные флюорохромами, под действием облучения их ультрафиолетовым светом испускают излучение в видимом спектре света. В случае, когда объект не окрашен специальными красителями, ультрафиолетовый свет, проходя через объектив и попадая на препарат, поглощается молекулярными структурами объекта и остается невидимым или почти невидимым для человеческого глаза. Если же какие-либо объекты окрашены специальным красителем, то молекулы красителя под действием ультрафиолета возбуждаются и начинают испускать кванты света в длинноволновой области (видимой части излучения), иначе говоря – светиться. В этом случае клетка становится источником света определенного спектра (цвета) и хорошо видна на общем темном контрастном фоне препарата.

При обработке препарата люминесцентными красителями (аурамин О, родамин С и др.), которые связываются с воскоподобными структурами микробной клетки, последующее облучение препарата возбуждающим источником света (определенный спектр ультрафиолетового излучения) вызывает оранжевое или ярко-желтое свечение окрашенных клеток микобактерий на черном или темно-зеленом фоне.

За счет свечения вокруг клетки образуется ореол, благодаря которому видимые размеры светящейся клетки превышают ее физические размеры. В связи с этим окрашенные флюорохромными красителями препараты обычно исследуются при увеличении 250х

– 450х, тогда как окрашенные фуксином – при увеличении 800х – 1000х. Разница в увеличении позволяет микроскописту видеть в люминесцентном микроскопе в 4–10 раз большее поле зрения, что существенно сокращает время, необходимое для просмотра мазка. Подсчитано, что, если микроскопическое исследование необходимой площади мазка при окраске по Ziehl-Neelsen составляет приблизительно 10–15 мин, то для исследования той же площади мазка методом ЛМ потребуется только 2–3 мин.

Наряду с этим при ЛМ отмечается значительно большая резкость и контрастность микроскопической картины, что повышает

РАЗДЕЛ 1. Лекционные материалы