2 курс / Гистология / курс_лекции_гистол_ТГМУ

11

Сканирующие, или растровые, микроскопы позволяют увидеть трехмерное изображение объекта, его поверхность. Принцип работы растрового электронного микроскопа заключается в том, что пучок электронов последовательно движется по поверхности гистологического объекта, на которую предварительно напылено твердое вещество. Под действием пучка электронов выбиваются вторичные электроны, которые регистрируются телевизионным экраном.

Так, последовательно «высвечивается» (сканируется) вся поверхность гистологического объекта. Рисунок 4 демонстрирует изображения объектов, получаемых с помощью трансмиссионного и сканирующего электронных микроскопов.

Рис. Изображения гистологических объектов, получаемые при помощи трансмиссионного и сканирующего электронных микроскопов, а – трансмиссионная микроскопия. Видно тонкое строение клеток и межклеточного вещества;

б, в – сканирующая микроскопия: видны детали поверхности клеток и межклеточных структур (а – по Ж.К.Роллану и соав., б, в – по Дюву)

движения электронов. Благодаря этому они значительно глубже, чем при обычной трансмиссионной микроскопии, проникают в изучаемый объект.

Высоковольтный микроскоп дает высокую разрешающую способность и позволяет изучать срезы толщиной до нескольких микрометров.

Гистохимия.

В основе гистохимических методов исследования лежит использование химических реакций для изучения различных химических компонентов клеток и тканей. Современные гистохимические методы позволяют выявлять в клетках аминокислоты, белки, жиры, углеводы, минеральные вещества и другие продукты. Поскольку

12

гистохимические методы позволяют оценивать функции клеток и тканей, их относят к морфофункциональным методам (рис. 5.).

Рис. Гистохимический метод выявления активности фермента щелочной фосфатазы в нейтрофильных лейкоцитах кожи при заживлении кожной раны.

По активности фермента можно судить о динамике регенераторного процесса, поскольку она характеризует некоторые функции нейтрофильных лейкоцитов. а – через 3 сут., б – через 10 сут. после нанесения раны.

Разновидностью гистохимии является также иммуногистохимия (иммуноцистохимия).

успешно перенесены в электронную микроскопию. Это привело к возникновению электронномикроскопической цито- и гистохимии и электронной иммуноцитохимии (иммуногистохимии).

Гистоавторадиография – метод, основанный на использовании радиоизотопов веществ, излучающих поток электронов. Для этого изотопами метят различные предшественники синтеза веществ в клетке: нуклеотиды, аминокислоты и другие. Затем

засвечивания, тем интенсивнее идет процесс включения изотопов в ткани, тем интенсивнее обмен в клетке. В последнее время разработаны методы электронной цито- (гисто)аутографии. Так же, как гистохимические методы, гистоавторадиография является морфофункциональным методом исследования.

Прижизненная микроскопия клеток и тканей.

Для прижизненной (витальной) микроскопии можно использовать метод культуры тканей, когда клетки помещаются на искусственную питательную среду и затем на ней культивируются. На такой среде они растут в виде монослоя. Эти клетки можно затем окрашивать и микроскопировать.

Для изучения живых клеток используют также метод цейтраферной съемки (киносъемки). При этом клетки в культуре тканей фотографируют с интервалами в 5 минут. Снятый таким образом фильм демонстрируют с частотой 24 кадра в секунду. При этом за короткое время можно увидеть все изменения, произошедшие с клетками в течение длительного времени. Цейтраферная съемка позволяет, например, проследить изменения происходящие в клетки при митотическом делении и др.

Цитомикрохирургия – метод, позволяющий производить на клетке микрооперации

– удаление частей клетки, пересадку ядра из одной клетки в другую и т.д. С этой целью используют специальный прибор микроманипулятор.

В гистологии широко используют также метод трансплантации тканей. Для этого кусочки органов или тканей пересаживают в различные участки тела животных – реципиентов. Далее изучают поведения трансплантатов, процессы жизнедеятельности в

13

них и взаимоотношения их с тканями реципиента.

Метод гибридизации

Этот метод основывается на специфическом связывании участков ДНК с комплементарными им маркированными фрагментами РНК или ДНК (так называемые зонды). Метод позволяет выявлять последовательность нуклеотидов в РНК и ДНК и, следовательно, локализацию определенных генов и продуктов их деятельности.

Методы количественной гистологии (морфометрия)

Всовременной гистологии значительный дополнительный объем информации о гистологическом объекте можно получить при помощи количественных методов. Наиболее простым количественным гистологическим исследованием является подсчет гистологических структур в поле зрения микроскопа или на единицу площадки среза. К морфометрическим методам относится также определение размеров гистологических объектов с помощью окуляр-микрометра – специальной микролинейки, вставленной в окуляре микроскопа.

С морфологической целью используются и морфометрические сетки При помощи морфометрической сетки можно определить объемные доли различных структур в гистологическом объекте.

Внастоящее время существуют достаточно сложные приборы, которые позволяют автоматически производить количественные гистологические и гистохимические исследования. Это так называемые автоматизированные системы анализа изображений (АСАИз). В их состав входят: сканирующий световой или электронный микроскоп; видеокамера, которая осуществляет просмотр объекта по двум координатам, а затем следует преобразование его в цифровую форму; ЭВМ, которая обрабатывает полученную информацию и представляет данные о характеристиках исследуемого объекта. С помощью светового дисплея исследователь имеет возможность выделить только интересующие его структуры и получить о них цифровую информацию в виде гистограмм

ит.д.

Цитоспектрофотометрия.

Это метод изучения химического состава клетки. Он основан на избирательном поглощении теми или иными веществами лучей с определенной длиной волны. По интенсивности поглощения (она зависит от конструкции вещества в клетке) определяют содержание этого вещества.

Цитоспектрофлуориметрия – это метод количественного изучения веществ в клетке по спектрам их флуоресценции.

Гистологическая техника.

Гистологическая техника – это техника, приготовления гистологического препарата. Гистологическим препаратом может быть срез органа, ткани, мазок, отпечаток, пленочный препарат, культура тканей. Во всех случаях гистологический препарат должен отвечать таким требованиям:

1.Быть прозрачным, т.е. пропускать поток света. Для этого изготавливают достаточно тонкие срезы органов, тканей, клеток.

2.Быть контрастным, что достигается окрашиванием препарата.

3. Быть постоянным, т.е. сохраняться длительное время и служить в качестве своеобразного документа.

Все эти требования к гистологическому препарату и выполняются в ходе гистологической техники.

Гистологическая техника включает в себя несколько этапов: 1. Взятие материала.

Во время операции;

От трупов;

От экспериментальных животных;

14

Путем пункционной биопсии;

Взятие крови, красного костного мозга путем пункции;

Приготовление отпечатков (с полости рта, влагалища и др.);

2. Фиксация материала. Фиксация полученного гистологического материала – это воздействие на него химическими веществами, а также физическими факторами, что препятствует дальнейшему разрушению тканей объекта, сохраняет его структуру. Например, фиксатор ФСУ состоит из 4 частей формалина, 1 части спирта и 0,3 частей уксусной кислоты. Этот фиксатор вызывает весьма незначительные изменения структуры объекта. Известно множество и других сложных фиксаторов.

3. Промывка. Для вымывания фиксатора из тканей используют воду или другие вещества (спирт).

4. Обезвоживание. Из объекта удаляют воду путем помещения его в спирты возрастающей концентрации.

5. Уплотнение материала. Проводится для того, чтобы из объекта можно было приготовить тонкие срезы. Выполняется путем заливки в парафин, целлоидин или целлоидин-парафин.

6. Изготовление срезов. Этот этап выполняется при помощи приборов микротомов (рис. 7.).

7. Удаление из срезов парафина. Срезы помещаются на предметное стекло, подсушиваются и помещаются в растворитель парафина – ксилол, толуол, бензол или в другие вещества.

8. Окрашивание срезов. При помощи окрашивания достигается контрастность препаратов. Для этого используют красители: кислые, основные и нейтральные. Примером кислого красителя может служить эозин, являющийся синтетическим красителем. Пример основного красителя – гемотоксилин. Они получаются из коры

Тинкториальные свойства тканей.

Под тинкториальными свойствами понимают способность тканей и клеток окрашиваться красителями. Для обозначения тинкториальных свойств используют такие

содержания в них основного белка гемоглобина.

2.Эозинофилия (вариант оксифилии) – способность структур окрашиваться кислым красителем эозином. Эозинофилией обладает цитоплазма многих клеток.

3.Ацидофилия – то же, что и оксифилия.

4. Базофилия – способность структур окрашиваться основными красителями. При этом структуры должны иметь кислую реакцию. Например, нуклеиновые кислоты (ДНК и РНК) обладают базофилией, т.к. по химическим законом могут связывать красители – основания. Благодаря этому ядро любой клетки в той или иной степени базофильно. Базофилией обладает также цитоплазма белоксинтезирующих клеток из-за содержащейся в многочисленных рибосомах РНК.

5. Полихроматофилия – способность структур клетки окрашиваться и кислым, и основными красителями. Таким качеством обладают, например гранулы нейтрофильных лейкоцитов. Чаще, однако, в качестве синонима используют термин

нейтрофилия.

6. Метахромазия – способность гистологических структур при связывании красителя изменять его цвет. При этом сами структуры окрашиваются в цвет, который отличается от цвета красителя в растворе. Чаще всего метахромазией обладают

15

углеводные соединения, и появление метахромазии говорит о присутствии в клетке или ткани сложных углеводов.

7.Аргентофилия – способность структур окрашиваться солями серебра.

8.Хромофилия – способность структур окрашиваться солями хрома.

9.Заключение, или консервация срезов. На срез наносят каплю

использоваться как своеобразный документ.

16

Лекция № 2. Клетка как структурно-функциональная единица ткани. Общий план строения. Цитоплазма. Строение органелл и включений.

Цитология – наука о клетке. Она изучает строение и функции тканевых клеток у многоклеточных организмов, одноклеточные организмы, процессы воспроизводства, роста клеток, их регенерации, приспособления к условиям внешней среды и другие процессы, позволяющие судить об общих для всех клеток свойствах и функциях.

Клетка – это элементарная структурная единица организма, состоящая из ядра, цитоплазмы и ограниченная клеточной оболочкой, способная выполнять все функции, характерные живому: обмен веществ и энергии, размножение, рост, раздражимость, сократимость, хранение и передачу генетической информации.

Основные положения клеточной теории. Клеточная теория явилась одним из наиболее важных открытий в биологии. Она дала толчок бурному развитию цитологии, эмбриологии и гистологии и является основополагающим учением. Клеточная теория была сформулирована в 1838 году немецкими учеными М.Шлейденом и Т.Шванном, а в дальнейшем развита Вирховым. М.Шлейден (1838) создал так называемую теорию цитогенеза, в которой впервые связал возникновение новых клеток не с их оболочкой, а с содержимым и, прежде всего, с ядром. После этого Т.Шванн (1838) показал, что в явлении цитогенеза скрывается общий принцип развития микроскопических структур всех организмов, позволяющий сделать заключение о принципиальном сходстве клеток всех тканей и органов. Наконец Р.Вирхов в 1859 году пересмотрел и развил клеточную теорию, выдвинув вместо представлений о цитогенезе положение “всякая клетка из клетки”.

Разработке клеточной теории предшествовали труды многих ученых. В 1824-1827 гг. французские ученые А.Дютроше, Ф.Распайл и Т.Тюрпен высказали предположение, что мешочки и пузырьками (т.е. клетки) являются элементарными структурными единицами всех растительных и животных тканей. Особо следует отметить чешского ученого Я.Пуркине, который в определенной степени предвосхитил создание клеточной теории. Он в 1837 году создал теорию “ядросодержащих зернышек”, т.е. клеток. Русский гистолог П.Ф.Горянинов на протяжении 1834-1847 гг. сформулировал принцип, согласно которому клетка является универсальной моделью организации живых организмов.

В настоящее время главные положения клеточной теории остаются незыблемыми. Клеточная теория в современной интерпретации включают следующие главные положения:

1.Клетка является универсальной элементарной единицей живого.

2.Клетки всех организмов принципиально сходны по строению, функции и химическому составу.

3.Клетки размножаются только путем деления исходной клетки.

4.Многоклеточные организмы являются сложными клеточными ансамблями, образующими целостные системы.

5.Клетки хранят, перерабатывают и реализуют генетическую информацию.

6.Благодаря деятельности клеток сложных организмов осуществляются рост, развитие, обмен веществ и энергии.

Строение клетки.

Клетка может существовать как самостоятельно, так и в составе ткани многоклеточных животных и растений. В составе ткани клетки являются важнейшим тканевым элементом. Все клетки делятся на прокариотические и эукариотичсекие. Прокариотичсекие клетки не имеют ядерной оболочки, не содержат органелл, ядра. Вся генетическая информация у них хранится в замкнутой в кольцо двойной цепи ДНК. Прокариотические клетки окружены жесткой клеточной стенкой. Они лишены митотического аппарата. К прокариотам относятся некоторые бактерии и водоросли.

Все остальные клетки являются эукариотическими. Они отличаются от прокариотов наличием хромосом, системы внутриклеточных мембран, из которых

17

построены органеллы. Цитоплазматические мембраны ограничивают также ядро, имеется митотический аппарат.

Организм взрослого человека состоит из примерно 1013 клеток, подразделяющихся на более чем 200 типов, существенно различающихся как строением, так и функциями. Однако при имеющихся несомненных различиях клетки всех этих типов имеют общие черты строения. Эукариотическая клетка состоит из таких компонентов (рис.6):

1.Клеточная оболочка.

2.Цитоплазма.

3.Ядро

Всвою очередь, каждый из этих компонентов клетки состоит из нескольких частей. Клеточная оболочка образована тремя частями: снаружи располагается гликокаликс, затем идет цитоплазматическая мембрана (цитолемма, плазмолемма), а под ней находится подмембранный слой опорно-сократительных структур.

Цитоплазма также состоит из трех частей: гиалоплазма, органелл и включений. Ядро построено из четырех компонентов:

1)ядерной оболочки, или кариолеммы;

2)ядрышка;

3)хроматина (хромосом);

4)ядерного сока (кариолимфы);

Клеточная оболочка.

Основной частью клеточной оболочки является цитоплазматическая мембрана (цитолемма), которая имеет строение элементарной биологической мембраны, являясь самой толстой из всех других клеточных мембран (7,5-11 мм).

Рис. Светомикроскопическое (а) и ультрамикроскопическое (б) строение эукариотической клетки.

а – микрофото: 1 – клеточная оболочка; 2 – ядро; 3 – цитоплазма; б – схема: 1 – ядро; 2 – цитоплазма;

3 – цитолемма; 4 – микроворсинки;

5 – десмосома; 6 – кариоплазма;

7 – ядрышка; 8 – хроматин;

9 – свободные рибосомы;

10– перунуклиарное пространство;

11– кариолемма; 12 – гранулярная ЭПС;

13– гладкая ЭПС; 14 – гликоген;

15– микрофиламенты; 16 – жир;

17– лизосомы; 18 – центросома;

19– комплекс Гольджи;

20 – митохондрия.

19

Функции биологических мембран.

1.Разграничительная – отделяют клетку от внеклеточной среды, ядро от цитоплазмы, содержимое органелл от их микросреды.

2.Барьерно-защитная: защищают внутреннюю среду клетки от действия вредных внешних факторов.

3.Рецепторная.

4.Транспортная: транспорт веществ в клетку-эндоцитоз, и из клетки-экзоцитоз.

5.Участие в межклеточных взаимодействиях: формирование межклеточных контактов, дистантные взаимодействия между клетками.

Второй частью клеточной оболочки является гликокаликс (рис. ). Он представлен

углеводными концами сложных белков (гликопротеинов) и сложных липидов (липопротеинов), входящих в состав цитомембраны. В гликокаликсе располагаются также поверхностные белки мембран, полуинтегральные белки. Их функциональные участки находятся в гликокаликсе. Эти белки могут играть роль ферментов. В гликокаликсе находятся рецепторы гистосовместимости, иммуноглобулины, могут адсорбироваться ферменты, рецепторы гормонов.

Функции гликокаликса: 1. Рецепторная (распознавание молекул соседних клеток и межклеточного вещества); 2. Межклеточные (адгезивные) контакты и взаимодействия; 3. Ориентация белков в мембране; 4. Участие в транспорте веществ.

Третий компонент клеточной оболочки – подмембранный слой опорносократительных структур. В его состав входят сократительные структуры – актиновые филаменты, а также опорный аппарат – кератиновые филоменты, микротрубочки. Подмембранный слой тесно связан с цитоскелетом с одной стороны, и рецепторами гликокаликса – с другой.

Функции модмембранного слоя: поддержание формы клетки, создание ее упругости, изменения клеточной поверхности, за счет чего клетка участвует в эндо и экзоцитозе, фагоцитозе, движении, секреции. С другой стороны, подмембранный слой связывает клеточную поверхность с компонентами цитоплазмы, поддерживает их упорядоченное расположение.

Понятия о циторецепторах.

Рецепторы представляют собой белковые молекулы на поверхности клетки, в ее цитоплазме или ядре, которые специфически реагируют с лигандами (гормонами, нейромедиаторами, факторами роста, цитокинами) или другими клетками. В соответствии со своей локализацией рецепторы делятся на поверхностные и внутриклеточные, а внутриклеточные подразделяются на цитоплазматические и ядерные.

Поверхностные рецепторы образованы поверхностными белками цитомембран, а также гликокаликсом. Они предназначаются для полярных лиганд, т.е. веществ, которые не могут проникнуть через клеточную мембрану внутрь клетки и оказывают свое действие на нее через систему внешних рецепторов и вторичных посредников (рис. 8). Подразделяются на каталитические рецепторы, рецепторы, связанными каналами, рецепторы, связанные с G-белками, и рецепторы, связывающие молекулы внеклеточного матрикса с цитоскелетом.

20

Молекулы адгезии клеток.

Адгезия – процесс взаимодействия специфических гликопротеинов соприкасающихся плазматических мембран распознающих друг друга клеток или клеток

ивнеклеточного матрикса. Все молекулы клеточной адгезии подразделяются на 5 классов.

1.Кадгерины – это трансмембранные гликопротеины использующие для адгезии ионы кальция. Отвечают за организацию цитоскелета, взаимодействие клеток с другими клетками.

2.Интегрины. Как уже отмечалось, интегрины представляют собой мембранные рецепторы для белковых молекул внеклеточного матрикса – фибронектина, ламинила и др. связывают внеклеточный матрикс с цитоскелетом при помощи внутриклеточных белков талина, винкулина, а – актинина. Функционируют как клеточно-внеклеточные, так

имежклеточные адгезионные молекулы.

3.Селектины. Обеспечивают прилипания лейкоцитов к эндотелию сосудов и тем самым лекоцитарно-эндотеальные взаимодействия, меграцию лейкоцитов через стенки сосудов ткани.

4.Семейство иммуноглобулинов. Эти молекулы играют важную роль в имунном ответе, а также в эмбриогенезе, заживление ран и др.

5.Гоминговые молекулы. Обеспечивают взаимодействие лимфоцитов с эндотелием, их миграцию и заселение специфических зон иммунокомпетентных органов.

Таким образом, адгезия является важным звеном клеточной рецепции, играет большую роль в межклеточных взаимодействиях клеток с внеклеточным матриксом. Адгезионные процессы абсолютно необходимы при таких общебиологических процессах, как эмбриогенез, иммунный ответ, рост, регенерация и др. Они участвуют также в регуляции внутриклеточного и тканевого гомеостаза.

Цитоплазма.

Основными структурами цитоплазмы являются, гиалоплазма (матрикс), органеллы и включения.

Гиалоплазма. Гиалоплазму называют также клеточным соком, цитозолем, или клеточным матриксом. Это основная часть цитоплазмы, составляющая около 53-55% объёма клетки. В ней осуществляются основные клеточные обменные процессы. Гиалоплазма является сложной коллоидной системой и состоит из гомогенного мелкозернистого вещества с низкой электронной плотностью. Она состоит из воды, белков, нуклеиновых кислот, полисахаридов, липидов, неорганических веществ. Гиалоплазма может менять свое агрегатное состояние: переходить из состояния жидкого (золь) в более плотное – гель. При этом может изменятся форма клетки, её подвижность и обмен веществ.

Функции гиалоплазмы:

1.Метаболическая – метаболизм жиров, белков, углеводов.

2.Формирование жидкой микросреды (матрикса клетки).

3.Участие в движение клетки, обмене веществ и энергии.

Органеллы.

Органеллы – это второй важнейший обязательный компонент клетки.

Органеллами называют структуры цитоплазмы, выполняющие конкретные функции, необходимые для поддержания жизнедеятельности клетки. Это обеспечение её энергетического обмена, синтетических процессов, транспорта веществ и т.п. По функциональному признаку все органеллы делятся на 2 группы.

1. Органеллы общего значения. Содержатся во всех клетках, поскольку необходимы для их жизнедеятельности. Такими органеллами являются: митохондрии, эндоплазматическая сеть двух видов, комплекс Гольджи, центриолы, рибосомы, лизосомы, пероксисомы, микротрубочки и микрофиламенты.