36. Методы вирусологии

Ответ. Вирусоскопический метод заключается в выявлении вируса в исследуемом материале под микроскопом. Чаще всего используют электронный микроскоп, реже – люминесцентный. Световая микроскопия применяется только для выявления крупных вирусов, с использованием методов сверхокраски. Кроме того, световую микроскопию используют для обнаружения внутриклеточных включений, образующихся в клетках при вирусных инфекциях. С помощью вирусоскопического метода можно диагностировать следующие заболевания: вирус простого герпеса, вирус краснухи, острый небактериальный гастроэнтерит и другие. Достоинство: дешевый и высокоэффективный метод. Недостатки: вирусоскопический метод позволяет выявлять только некоторые заболевания. Окраска по Селлеру. Влажный мазок или отпечаток без фиксации 10 секунд окрашивают смесью из насыщенных растворов в метиловом спирте основного фуксина (3−5 мл) и метиленового синего (15 мл) и чистого метилового спирта (25 мл). Промывают проточной водой, сушат на воздухе, и препарат готов для микроскопии. Тельца Бабеша – Негри пурпурно-красные, цитоплазма ядра и ядрышка синяя, эритроциты кирпично-красные. Вирусологический метод заключается в заражении исследуемым материалом чувствительной биологической модели (лабораторные животные, куриные эмбрионы или культуры клеток), индикации вируса и его дальнейшая идентификация. Достоинством этого метода является 100 % достоверность (достоинство). При заражении лабораторных животных идентификацию вирусов проводят по клинической картине болезни, патологоанатимическим изменениям; окончательная диагностика осуществляется индикацией вирусов в материале от животных, например, с помощью реакции гемагглютинации. Эта же реакция позволяет выявлять вирусы в курином эмбрионе. В культуре клеток наличие вирусов определяют по цитопатическому действию (в частности, образованию внутриклеточных включений), гемадсорбции, феномену бляшкообразования, реакцией гемагглютинации, цветной пробой. Идентификацию вируса осуществляют с помощью серологических реакций (РПГА, РТГА, РН, РСК и др.). Данный метод позволяет точно определить природу возбудителя, но он требует много времени (5-7 дней), значительных материальных затрат, и опасен (достоинство и недостатки). Серологические исследования − это методы изучения определенных антител или антигенов в сыворотке крови больных, основанные на реакциях иммунитета. С их помощью также выявляют антигены микробов или тканей с целью их идентификации. Обнаружение в сыворотке крови больного антител к возбудителю инфекции или соответствующего антигена позволяет установить причину заболевания. Серологические исследования применяют также для определения антигенов групп крови, тканевых антигенов и уровня гуморального звена иммунитета. Серологические исследования включают в себя различные серологические реакции: реакция агглютинации; реакция преципитации; реакция нейтрализации; реакция с участием комплемента; реакция с использованием меченых антител или антигенов. Реакции агглютинации — это простые реакции склеивания корпускулярных антигенов с помощью антител. Различают: прямые реакции агглютинации, которые используют для выявления антител в сыворотке крови больного. Добавление взвеси убитых микробов к сыворотке больного вызывает образование хлопьевидного осадка (положительная реакция склеивания микробов антителами). Используется для определения брюшного тифа, паратифа и др; реакция пассивной, или непрямой гемагглютинации основана на использовании эритроцитов с адсорбированными на их поверхности антигенами, взаимодействие которых с соответствующими антителами сыворотки крови больных приводит к образованию фестончатого осадка. Используется для определения беременности, выявления повышенной чувствительности больных к лекарственным препаратам и гормонам; реакция торможения гемагглютинации основана на способности антител иммунной сыворотки нейтрализовать вирусы, которые в результате теряют свойство склеивать эритроциты. Используется для диагностики вирусных болезней; реакция коагглютинации − разновидность реакции агглютинации, в которой антигены возбудителя определяют с помощью стафилококков, предварительно обработанных иммунной диагностической сывороткой. Реакции преципитации − реакции, в которых происходит осаждение комплекса антиген-антитело. Антиген в данном случае должен быть растворимым. Осадок комплекса антиген-антитело называется преципитатом. Реакцию ставят путем наслоения раствора антигена на иммунную сыворотку. При оптимальном соотношении антиген-антитело на границе этих растворов образуется непрозрачное кольцо преципитата. Диаметр кольца преципитации пропорционален концентрации антигена. Наибольшее распространение получила реакция преципитации в полужидком геле агара (двойная иммуно-иммунодиффузия, иммуноэлектрофорез и др.). Реакцию используют для определения содержания в крови иммуноглобулинов различных классов, компонентов системы комплемента. Реакция нейтрализации основана на способности антител иммунной сыворотки нейтрализовать повреждающее действие микроорганизмов или их токсинов на чувствительные клетки или ткани. При отсутствии повреждающего эффекта смеси антител и микробов или их токсинов на культуру клеток говорят о специфичности взаимодействия комплекса антиген-антитело. Реакции с участием комплемента основаны на активации комплемента в результате присоединения его к комплексу антиген-антитело. Если комплекс антиген-антитело не образуется, то комплемент присоединяется к комплексу эритроцит-антиэритроцитарное антитело, вызывая тем самым гемолиз (разрушение) эритроцитов (реакция радиального гемолиза). Применяется для диагностики инфекционных болезней, в частности, сифилиса. Реакция основана на том, что антигены тканей или микробы, обработанные иммунными сыворотками, меченными флюорохромами, способны светиться в ультрафиолетовых лучах люминисцентного микроскопа (реакция иммунофлюоресценции). В иммуноферментном анализе вместо флюорохромов иммунную сыворотку можно метить ферментом (пероксидазой хрена или щелочной фосфатазой). Реакцию оценивают по окрашиванию раствора в желто-коричневый (пероксидаза) или желто-зеленый (фосфотаза) цвет. Радиоиммунологический метод — количественное определение антител или антигенов, меченых радионуклидами, с применением аналогичных антигенов или антител. Методы применяют для выявления антигенов микробов, определения гормонов, ферментов, лекарственных веществ и иммуноглобулинов. Молекулярно-биологические методы широко используются для диагностики инфекционных болезней и паразитозов. Наиболее широко применяется метод ПЦР (полимеразная цепная реакция). ПЦР позволяет диагностировать: гепатит, ВИЧ, туберкулез, малярия, воспаления органов половой системы и мочевыводящих путей, гистоплазмоз, ротавирусные инфекционные заболевания, ветряная оспа, герпес, вирус папилломы человека и еще несколько десятков болезней. Достоинство: быстрая и корректная диагностика. Недостатки: дорогостоящие методы.