Электронная микроскопия

Возможности оптических микроскопов ограничены слишком большой длиной волны видимого света (6000 А). Объекты, размеры ко­торых меньше этой величины, находятся за пределами разрешающей способности светового микроскопа. В электронном микроскопе вместо световых волн используются электронные лучи, обладающие чрезвы­чайно малой длиной волны и высокой разрешающей способностью (см. рис. 1.17).

В качестве источника электронных лучей применяют электронную пушку, основой которой служит вольфрамовая нить, нагретая электри­ческим током. Между вольфрамовой нитью и анодом на пути электро­нов находится электрическое поле высокого напряжения. Электронный поток вызывает свечение фосфоресцирующего экрана. Проходя через объект, части которого имеют различную толщину, электроны будут со­ответственно задерживаться, что проявится на экране участками затем­нения. Объект приобретает контрастность.

Препараты для электронной микроскопии готовят на тончайших коллоидных пленках, исследуют объекты после их высушивания («на- тивные препараты»), напыления при помощи тяжелых металлов, уль­тратонких срезов метода реплик и др.

С помощью электронной микроскопии можно обнаружить самые мелкие структуры, получить увеличение до 200 000 и увидеть объекты размером 0,002 мкм.

Рис. 1.17. Схема трансмиссионного электронного микроскопа

1.2. Физиология микроорганизмов 1.2.1. Питание бактерий

Бактерии, как и все другие организмы, для существования и вос­производства себе подобных нуждаются в постоянном обмене веществ с окружающей средой. Превращения веществ в клетке (метаболизм) представлены противоположными, но и взаимосвязанными процессами, направленными, во-первых, на распад сложных питательных веществ на более простые, это звено метаболизма называется катаболизмом, а, во- вторых, на превращения простых веществ в ходе реакций промежуточ­ного обмена в более сложные низкомолекулярные соединения, из кото­рых далее синтезируются полимерные макромолекулы. Это, второе, звено метаболизма называется анаболизмом.

Для осуществления процессов метаболизма питательные вещества проникают в бактериальную клетку извне через цитоплазматическую мембрану, при этом клеточная стенка не служит препятствием для про­хождения ионов и мелких молекул. Мембранные белки - пермеазы или транслоказы - обладают ферментативными свойствами и помогают осуществлять транспорт веществ в клетку. Различают три механизма транспорта, два из них обеспечивают только передачу, но не накопле­ние веществ в клетке. Это простая или пассивная диффузия и облег­ченная диффузия. Простая диффузия не специфична, для нее имеет значение только величина молекул. Путем простой диффузии в клетку проникают чужеродные для нее вещества - яды, ингибиторы, лекар­ственные препараты. При облегченной диффузии в клетку проникают те молекулы, концентрация которых в цитоплазме ниже, чем в окружаю­щей среде. Этот процесс осуществляется благодаря субстрат- специфической пермеазе. Затрат энергии при этом не происходит. Тре­тий механизм питания клетки - активный транспорт. Он тоже проис­ходит с участием субстратных белков ферментов, но при этом затрачи­вается энергия, а проникшие в клетку вещества накапливаются в ней. Молекулы, проникшие в клетку путем активного транспорта через мем­брану, претерпевают химические превращения, например фосфорили- рование.

Выход продуктов метаболизма из бактериальной клетки в окру­жающую среду также осуществляется путем неконтролируемой диффу­зии или при участии транспортных систем - в тех случаях, когда в ре­зультате процессов брожения, неполного окисления или нарушений ме­таболизма вещества накапливаются в клетке в количествах, превышаю­щих физиологическую норму.

Для роста и размножения бактерий, а следовательно и для их пи­тания необходимы различные химические соединения, растворенные в воде. По количественному вкладу в построение клетки различают мак­ро- и микроэлементы. К макроэлементам относят 10 элементов таблицы Менделеева: углерод, водород, кислород, азот, серу, калий, кальций, фосфор, магний, железо. Микроэлементы нужны бактериям в очень ма­лых, следовых, количествах: они представлены марганцем, молибденом, цинком, медью, кобальтом, никелем, хлором, бромом и некоторыми другими металлами и неметаллами. Большинство из них содержится в виде примесей в макроэлементах или может попадать в питательные среды из стеклянной посуды, воды или воздуха. Некоторые бактерии могут обходиться и без микроэлементов.

По потребности в углероде бактерии делятся на две большие группы: автотрофы (или литотрофы) и гетеротрофы (или органо- трофы).

Бактерии-автотрофы способны получать энергию путем окис­ления неорганических соединений. Они, как правило, используют СО2 как основной источник, содержащий углерод в наиболее окисленной форме. Поэтому при культивировании автотрофов необходимо обеспе­чить клетки углекислотой, так как концентрация СО₂ в воздухе не пре­вышает 0,03 % и ее поступление в среду за счет диффузии недостаточно для роста микроорганизмов. В питательные среды для культивирования автотрофов вносят карбонат кальция (СаСО3) или бикарбонат натрия (№НСО₃). Иногда через питательную среду продувают воздух, обога­щенный 1-5 % СО₂.

Бактерии-гетеротрофы получают углерод из органических со­единений. В зависимости от индивидуальных особенностей микроорга­низмов источником углерода могут быть разные органические соедине­ния - спирты, углеводы, ароматические соединения, органические кис­лоты.

Гетеротрофы, в свою очередь, разделяются на сапрофитов, жи­вущих за счет органических соединений, поступающих в бактериаль­ную клетку из внешней среды, и паразитов, способных утилизировать только продукты метаболизма внутри живой клетки. Паразитизм может быть факультативным и абсолютным (или облигатным).

Для роста микроорганизмов также необходим азот, который вхо­дит в состав органических соединений или солей в разной степени вос­становления. Это могут быть соли аммония, нитраты или отдельные аминокислоты. Для удовлетворения потребности бактерий в азоте ис­пользуют также продукты неполного расщепления белков животного происхождения - гидролизаты, пептоны и сложные белковые смеси - нативную сыворотку животных, асцитическую жидкость и др.

Кроме углерода, азота и других химических элементов, многие бактерии нуждаются в факторах роста, к которым относятся витамины, основания нуклеиновых кислот и другие биологически активные веще­ства. По этому признаку микроорганизмы можно разделить на две группы: ауксотрофы, для которых в среде необходимо наличие одного или нескольких факторов роста, и прототрофы, они в факторах роста не нуждаются.

В среде обитания бактерий кроме биосинтетического должен находиться и энергетический материал. По способу получения энергии бактерии также принято делить на две группы: хемотрофы и фототро- фы. Хемотрофы используют энергию окисления различных соедине­ний. В зависимости от окисляемого субстрата среди хемотрофных орга­низмов выделяют хемолитотрофы и хемоорганотрофы. Фототрофы для удовлетворения энергетических потребностей используют энергию света.