1.1.3. Структура бактериальной клетки и методы ее исследования

Бактерии являются прокариотами (см. рис. 1.2) и существенно от­личаются от клеток растений и животных (эукариотов). Они относятся к одноклеточным организмам и состоят из клеточной стенки, цитоплаз- матической мембраны, цитоплазмы, нуклеоида (обязательных компо­нентов бактериальной клетки). Некоторые бактерии могут иметь жгути­ки, капсулы, споры (необязательные компоненты бактериальной клет­ки).

Включения Нефотоситезирцющие Основные

(запасные вещества) мембранные структуры структуры

Рис. 1.2. Комбинированное схематическое изображение прокариотиче- ской (бактериальной) клетки со жгутиками.

1 - гранулы полиоксимасляной кислоты; 2 - жировые капельки; 3 - включе­ния серы; 4 - трубчатые тилакоиды; 5 - пластинчатые тилакоиды; 6 - пузырьки; 7 - хроматофоры; 8 - ядро (нуклеоид); 9 - рибосомы; 10 - цитоплазма; 11 - базальное тельце; 12 - жгутики; 13 - капсула; 14 - клеточная стенка; 15 - цитоплазматическая мембрана; 16 - мезосома; 17 - газовые вакуоли; 18 - ламеллярные структуры; 19 - гранулы полисахарида; 20 - гранулы полифосфата

Клеточная стенка

Клеточная стенка представляет собой внешнюю структуру бакте­рий толщиной 30-35 нм, главным компонентом которой является пеп- тидогликан (муреин). Пептидогликан является структурным полимером, состоящим из чередующихся субъединиц N-ацетилглюкозамина и N- ацетилмурамовой кислоты, соединенных гликозидными связями (рис. 1.3).

Рис. 1.3. Схематическое изображение однослойной структуры пептидо-

гликана

Параллельно расположенные полисахаридные (гликановые) цепи скреплены между собой поперечными пептидными мостиками (рис. 1.4).

Рис. 1.4. Детальное строение структуры пептидогликана Светлые и черные короткие стрелки указывают связи, расщепляемые соот­ветственно лизоцимом (мурамидазой) и специфической муроэндопептидазой

Полисахаридный каркас легко разрушается лизоцимом - антибио­тиком животного происхождения. Пептидные связи являются мишенью для пенициллина, который ингибирует их синтез и препятствует фор­мированию клеточной стенки. Количественное содержание пептидогли-

кана влияет на способность бактерий окрашиваться по Граму. Бактерии, имеющие значительную толщину муреинового слоя (90-95 %), стойко окрашиваются генцианвиолетом в сине-фиолетовый цвет и носят назва­ние грамположительных бактерий. Грамотрицательные бактерии с тонким слоем пептидогликана (5-10 %) в клеточной стенке после дей­ствия спирта утрачивают генцианвиолет и дополнительно окрашивают­ся фуксином в розовый цвет. Клеточные стенки у грамположительных и грамотрицательных прокариот резко различаются как по химическому составу (см. табл. 1.1), так и по ультраструктуре (см. рис. 1.5).

? j 'V

Рис. 1.5. Схематическое изображение клеточной стенки у грамположи­тельных (а) и грамотрицательных (б) прокариот: 1 - цитоплазматическая мембрана; 2 - пептидогликан; 3 - периплазматиче- ское пространство; 4 - наружная мембрана; 5 - ДНК

а 6

Химический состав клеточных стенок грамположительных и грамотрицательных прокариот

Кроме пептидогликана, в клеточной стенке грамположительных бактерий содержатся тейхоевые кислоты (полифосфатные соединения), в меньшем количестве - липиды, полисахариды, белки.

Таблица 1. 1

Компоненты клеточной стенки	Грамположитель- ные прокариоты	Грамотрицательные прокариоты
		внутренний слой (пептидоглика- новый)	внешний слой (наружная кле­точная мембра­на)
Пептидогликан	+	+	-
Тейхоевые кислоты	+	-	-
Полисахариды	+	-	+

Окончание Табл. 1.1

Белки	±	—	+
Липиды	±	—	+
Липополисахариды	—	—	+
Липопротеины	—	±	+

Грамотрицательные прокариоты имеют наружную мембрану, в состав которой входят липиды (22 %), белки, полисахариды, липопро- теины.

Клеточная стенка у бактерий выполняет в основном формообра­зующую и защитную функции, обеспечивает ригидность, формирует капсулу, определяет способность клеток к адсорбции фагов.

Все бактерии, в зависимости от их отношения к окраске по Граму, делятся на грамположительные и грамотрицательные.

Методика окраски по Граму

1. На мазок кладут фильтровальную бумагу и наливают карболо­вый раствор генцианового фиолетового на 1-2 мин.

2. Снимают бумагу, сливают краситель и, не промывая мазок во­дой, наливают раствор Люголя на 1 мин.

3. Сливают раствор Люголя и обесцвечивают препарат в 96 %-м спирте в течение 30 сек.

4. Промывают водой.

5. Красят 1-2 мин водным раствором фуксина.

6. Промывают водой и высушивают.

В результате окраски грамположительные бактерии окрашивают­ся в фиолетовый цвет, грамотрицательные - в красный.

Причину различного отношения бактерий к окраске по Граму объясняют тем, что после обработки раствором Люголя образуется не­растворимый в спирте комплекс йода с генциановым фиолетовым. Этот комплекс у грамположительных бактерий, в связи со слабой проницае­мостью их стенки, не может диффундировать, в то время как у грамот- рицательных - легко удаляется при промывании их этанолом, а затем водой.

Бактерии, полностью лишенные клеточной стенки, называются протопластами, они имеют шаровидную форму, обладают способно­стью к делению, дыханию, синтезу белков, нуклеиновых кислот, фер­ментов. Протопласты являются неустойчивыми структурами, очень

чувствительными к изменениям осмотического давления, механических воздействий и аэрации, не обладают способностью синтезировать со­ставные части клеточной стенки, не подвергаются инфицированию ви­русами бактерий (бактериофагами) и не обладают активной подвижно­стью.

Если под влиянием лизоцима и других факторов происходит ча­стичное растворение клеточной стенки, то бактериальные клетки пре­вращаются в сферические тела, получившие название сферопластов.

Под воздействием некоторых внешних факторов бактерии спо­собны терять клеточную стенку, образуя L-формы (названы в честь ин­ститута им. Д. Листера, где были впервые выделены); подобная транс­формация может быть спонтанной (например, у хламидий) или индуци­рованной, например, под воздействием антибиотиков. Выделяют ста­бильные и нестабильные L-формы. Первые не способны к реверсии, а вторые реверсируют в исходные формы после удаления причинного фактора.

Цитоплазматическая мембрана

Цитоплазма бактериальной клетки ограничена от клеточной стен­ки тонкой полупроницаемой структурой толщиной 5—10 нм, называемой цитоплазматической мембраной (ЦПМ). ЦПМ состоит из двойного слоя фосфолипидов, пронизанных белковыми молекулами (рис. 1.6).

Рис.1.6. Строение плазматической мембраны Два слоя фосфолипидных молекул, обращенных гидрофобными полюсами друг к другу и покрытых двумя слоями молекул глобулярного белка.

С ЦПМ связаны многие ферменты и белки, участвующие в пере­носе питательных веществ, а также ферменты и переносчики электро­нов конечных стадий биологического окисления (дегидрогеназы, цито- хромная система, АТФ-аза). На ЦМП локализуются ферменты, катали­зирующие синтез пептидогликана, белков клеточной стенки, собствен­

ных структур. Мембрана является также местом превращения энергии при фотосинтезе.

Периплазматическое пространство

Периплазматическое пространство (периплазма) представляет со­бой зону между клеточной стенкой и ЦПМ. Толщина периплазмы со­ставляет около 10 нм, объем зависит от условий среды и прежде всего от осмотических свойств раствора. Периплазма может включать до 20 % всей находящейся в клетке воды, в ней локализуются некоторые фер­менты (фосфатазы, пермеазы, нуклеазы и др.) и транспортные белки — переносчики соответствующих субстратов.

Цитоплазма

Содержимое клетки, окруженное ЦПМ, составляет цитоплазму бактерий. Та часть цитоплазмы, которая имеет гомогенную коллоидную консистенцию и содержит растворимые РНК, ферменты, субстраты и продукты обмена веществ, обозначается как цитозоль. Другая часть ци­топлазмы представлена различными структурными элементами: мезо- сомами, рибосомами, включениями, нуклеоидом, плазмидами.

Рис. 1.7. Рибосома (а) и ее субчастицы — большая (б) и малая (в) Рибосомы служат местом синтеза белка.

а б Е

Цитоплазматические включения

Нередко в цитоплазме бактерий обнаруживаются различные включения, которые образуются в процессе жизнедеятельности: капель­ки нейтральных липидов, воска, серы, гранулы гликогена, в-

Рибосомы — субмикроскопические рибонуклеопротеиновые гра­нулы диаметром 15—20 нм. В рибосомах находится примерно 80—85 % всей бактериальной РНК. Рибосомы прокариот имеют константу седи­ментации 70 S. Они построены из двух частиц: 30 S (малая субъедини­ца) и 50 S (большая субъединица) (рис. 1.7).

гидроксимасляной кислоты (особенно у рода Bacillus). Гликоген и в- гидроксимасляная кислота служат для бактерий запасным источником энергии. У некоторых бактерий в цитоплазме находятся кристаллы бел­ковой природы, обладающие ядовитым действием на насекомых.

Некоторые бактерии способны накапливать фосфорную кислоту в виде гранул полифосфата (зерна волютина, метахроматические зерна). Они играют роль фосфатных депо и выявляются в виде плотных обра­зований в форме шара или эллипса, располагающихся в основном у по­люсов клетки. Обычно на полюсах бывает по одной грануле.

Нуклеоид

Нуклеоид — ядерный аппарат бактерий. Представлен молекулой ДНК, соответствующей одной хромосоме. Она замкнута, располагается в ядерной вакуоле, не имеет ограничивающей от цитоплазмы мембраны.

С ДНК связано небольшое количество РНК и РНК-полимеразы. ДНК свернута вокруг центрального стержня, состоящего из РНК, и представляет собой высокоупорядоченную компактную структуру. Хромосомы большинства прокариот имеют молекулярную массу в пре­делах 1—3х10⁹, константу седиментации 1300-2000 S. Молекула ДНК включает 1,6х10 нуклеотидных пар. Различия в генетическом аппарате прокариотических и эукариотических клеток обусловливают его назва­ние: у первых — нуклеоид (образование, подобное ядру), в отличие от ядра у вторых.

В нуклеоиде бактерий содержится основная наследственная ин­формация, которая реализуется в синтезе специфических белковых мо­лекул. С ДНК бактериальной клетки связаны системы репликации, ре­парации, транскрипции и трансляции.

Нуклеоид в прокариотической клетке может быть выявлен в окрашенных препаратах с помощью светового или фазово-контрастного микроскопа.

У многих бактерий в цитоплазме обнаружены внехромосомные генетические элементы — плазмиды. Они представляют собой замкну­тые в кольца двухцепочечные ДНК, состоящие из 1500—40000 пар нук- леотидов и содержащие до 100 генов.

Капсула

Капсула — слизистый слой клеточной стенки бактерий, состоящий из полисахаридов или полипептидов. Микрокапсулу (толщиной менее 0,2 мкм) способны формировать большинство бактерий.

Жгутики

Жгутики выполняют роль органа движения, позволяющего бакте­риям передвигаться со скоростью 20—60 мкм/сек. Бактерии могут иметь один или несколько жгутиков, располагающихся по всей поверхности тела либо собранных в пучки у одного полюса, у разных полюсов. Тол­щина жгутиков в среднем составляет 10-30 нм, а длина достигает 10-20 мкм.

Основу жгутика составляет длинная спиральная нить (фибрилла), которая у поверхности клеточной стенки переходит в утолщенную изо­гнутую структуру - крюк и прикрепляется к базальной грануле, вмон­тированной в клеточную стенку и ЦПМ (см. рис. 1.8).

Рис. 1.8. Схематическая модель базального конца жгутика Е. coli, осно­ванная на электронных микрофотографиях выделенной органеллы

Базальные гранулы имеют диаметр около 40 нм и состоят из не­скольких колец (одна пара - у грамположительных бактерий, четыре - у грамотрицательных прокариот). Удаление пептидогликанового слоя клеточной стенки ведет к потере способности бактерий к движению, хо­тя жгутики при этом остаются неповрежденными.

Жгутики почти полностью состоят из белка флагеллина с некото­рым содержанием углеводов и РНК.

Споры

Некоторые бактерии в конце периода активного роста способны образовывать споры. Этому предшествует обеднение среды питатель­ными веществами, изменение ее рН, накопление ядовитых продуктов метаболизма. Как правило, одна бактериальная клетка образует одну спору - локализация спор различна (центральная, терминальная, субтерминальная - рис. 1.9).

Рис. 1.9. Типичные формы спорообразующих клеток

Если размеры спор не превышают поперечного размера палочко­видной бактерии, то последняя называется бациллой. Когда диаметр споры больше - бактерии имеют форму веретена и носят название кло- стридий.

По химическому составу различие спор от вегетативных клеток состоит лишь в количественном содержании химических соединений. Споры содержат меньше воды и больше липидов.

В состоянии споры микроорганизмы метаболически неактивны, выдерживают высокую температуру (140-150 °С) и воздействие хими­ческих дезинфицирующих веществ, длительно сохраняются в окружа­ющей среде.

Попадая в питательную среду, споры прорастают в вегетативные клетки. Процесс прорастания спор включает три стадии: активации, начальной стадии и стадии роста. К активирующим агентам, нарушаю­щим состояние покоя, относят повышенную температуру, кислую реак­цию среды, механические повреждения и др. Спора начинает поглощать воду и с помощью гидролитических ферментов разрушает многие соб­ственные структурные компоненты. После разрушения наружных слоев наступает период формирования вегетативной клетки с активацией био­синтеза, заканчивающейся делением клетки.