4.5. Меры безопасности

Генетическая инженерия с момента зарождения привлекла внима­ние ученых и широких кругов общественности потенциальной опасно­стью некоторых исследований. Это опасение было высказано в 1974 г., вскоре после первых успешных экспериментов по получению рекомби- нантных молекул ДНК. Группа известных молекулярных биологов во главе с П. Бергом призвала ученых к ограничению проведения ряда ген­но-инженерных экспериментов. Характер высказанных опасений был двоякого рода. Во-первых, указывалось на реальную возможность «утечки» клеток с рекомбинантными молекулами ДНК за пределы ла­бораторий или промышленных производств и, следовательно, угрозу внесения в организм человека или животных вредных чужеродных либо «собственных» продуктов (например, гормонов), но в неконтролируе­мых концентрациях. Во-вторых, отсутствие достаточных знаний о структуре и функциях генов, находящихся в клонируемом фрагменте ДНК, может привести к тому, что при внесении их в реципиентные клетки они начнут синтезировать не только желаемое вещество, но и какие-либо опасные продукты (например, токсины, продукты онкоге­нов, т. е. генов, чьи продукты обладают способностью трансформиро­вать эукариотические клетки так, что они приобретают свойства опухо­левых клеток).

В 1975 г. данные проблемы обсуждались на Международной кон­ференции, посвященной вопросам получения рекомбинантных молекул ДНК. В ней приняли участие ученые разных областей биологии, а также юристы, представители прессы, государственных и частных промыш­ленных компаний. Участники конференции пришли к выводу, что экс­перименты с использованием методов генетической инженерии должны продолжаться, но при обязательном соблюдении определенных правил и рекомендаций.

В настоящее время в России работы генно-инженерного плана ре­гулируются федеральным законом, принятым в 1996 г. Они подразде­ляются на два типа - ведущиеся в «закрытых» или «открытых» систе­мах. В закрытых системах работы ведутся так, что имеется химический, биологический или физический барьер между генно-инженерными ор­ганизмами и окружающей средой. В открытых системах такой контакт осуществляется (например, культивирование генно-инженерных ово­щей и злаков).

Глава 5. Промышленная микробиология

5.1. Производство первичных метаболитов

Первичные метаболиты - низкомолекулярные соединения, не­обходимые для роста микробов: одни из них являются строительными блоками макромолекул, другие - участвуют в синтезе коферментов. Среди наиболее важных для промышленности первичных метаболитов можно выделить аминокислоты, органические кислоты, нуклеотиды и витамины.

5.1.1. Производство аминокислот

Производство аминокислот в мире постоянно растет и в настоя­щее время составляет около 400 тыс. тонн/год, хотя потребность в них оценивается гораздо выше.

Как уже отмечалось, недостаток в рационе аминокислот (особен­но, незаменимых) отрицательно сказывается на росте и развитии. Так, добавка к кормам животных нескольких долей % дефицитной кислоты может повысить кормовую ценность белка более чем в два раза.

Из всех возможных способов получения аминокислот (химиче­ским путем, микробиологическим и др.) предпочтение отдается микро­биологическому: хотя организацию микробного производства нельзя назвать простой, ее преимущество состоит в синтезе оптически чистых (L-аминокислот), тогда как при химическом синтезе получается ра­цемическая смесь L- и D-аминокислот, которую трудно разделить.

Микробный синтез аминокислот основан на культивировании строго определенного продуцента целевой кислоты в среде заданного состава при строго определенных параметрах ферментации. Продуцен­тами являются штаммы бактерий, полученные мутантной селекцией или с помощью методов генной инженерии. Бактерии-мутанты, с одной сто­роны, утратили способность самостоятельно синтезировать некоторые вещества, а с другой стороны, приобрели способность к сверхсинтезу целевой аминокислоты. Уже к 70-м годам прошлого века были получе­ны микробы-суперпродуценты из родов Brevibacterium, Corynebacterium, Micrococcus и др. с помощью которых возможно производить все из­вестные аминокислоты. В настоящее время имеются суперпродуценты, у которых количество синтезируемого специфического белка достигает 10-50 % (здесь важнейшую роль играют многокопийные плазмиды, не­сущие встроенные гены).

Технология получения аминокислот базируется на принципах ферментации продуцентов и выделения первичных метаболитов, т. е. размножают маточную культуру вначале на агаризованной среде в про­

бирках, затем - на жидкой среде в колбах, инокуляторах и посевных ап­паратах, а затем - в основных ферментаторах.

Если аминокислота предусмотрена в качестве добавки к кормам, то биотехнологический процесс кормового продукта включает следую­щие стадии: ферментацию, стабилизацию аминокислоты в культураль- ной жидкости перед упариванием, вакуум-упаривание, стандартизацию упаренного раствора при добавлении наполнителя, высушивание и упа­ковку готового продукта, в котором должно содержаться не более 10 % основного вещества. Если же аминокислота используется в качестве ле­карственного препарата, в этом случае получают изолированные чистые кристаллы, которые высушивают под вакуумом и упаковывают.

Известны два способа получения аминокислот: одноступенчатый и двухступенчатый. Согласно первому способу, например, мутантный ауксотрофный штамм - продуцент аминокислоты - культивируют на оп­тимальной для биоситеза среде. Целевой продукт накапливается в куль- туральной жидкости, из которой его выделяют согласно определенной технологической схеме.

II ступень

В двухступенчатом способе микроб-продуцент культивируют в среде, где он получает и синтезирует все необходимые ингредиенты для последующего синтеза целевого продукта. Схема двухступенчатого процесса может быть представлена в следующем виде:

Микроб - продуцент аминокислоты

культивирование в жидкой питательной среде

I ступень

Биосинтез предшественников аминокислоты и ферментов, катализирующих биосинтез целевого продукта

Биосинтез целевого продукта с участием ферментов

Аминокислота - целевой продукт

Если ферменты биосинтеза аминокислоты накапливаются внутри- клеточно, то после 1-й ступени клетки сепарируют, дезинтегрируют и применяют клеточный сок. В других случаях для целей биосинтеза це­левых продуктов применяют непосредственно клетки.

Получение лизина

Типичными продуцентами L-лизина являются бактерии Brevibac- terium flavum и Corynebacterium glutamicum.

Чтобы добиться образования лизина в больших количествах, полу­чают мутанты двух типов. У мутантов первого типа не синтезируется или не функционирует гомосериндегидрогеназа, в результате чего бло­кируется синтез метионина и треонина. Такие мутанты являются ауксо- трофами по гомосерину или треонину (метионину); внутриклеточная концентрация треонина у них существенно снижена, что снимает бло­каду с аспартаткиназы. Поэтому при выращивании мутантных штаммов в среде, где присутствуют лимитирующие концентрации метионина и треонина, они способны образовывать избыточные количества лизина. Мутанты второго типа дефектны по структурному гену, детерминиру­ющему конформацию аспартаткиназы. В итоге фермент теряет чувстви­тельность к высоким концентрациям аллостерического ингибитора — лизина.

Важный фактор, обеспечивающий в культуральной среде высокие концентрации аминокислоты, синтезированной внутри клетки, — про­ницаемость клеточных мембран. Проницаемость клеточной мембраны увеличивают либо с помощью мутаций, либо путем изменения состава питательной среды. В последнем случае в культуральной среде создают дефицит биотина (1 - 5 мкл/л), добавляют пенициллин (2 - 4 мкг/л), де­тергенты (твин-40 и твин-60) или производные высших жирных кислот (пальмитаты, стеараты). Биотин контролирует содержание в клеточной мембране фосфолипидов, а пенициллин нарушает биосинтез клеточных стенок бактерий, что повышает выделение аминокислот в среду.

Для культивирования штаммов микроорганизмов при производстве аминокислот как источники углерода наиболее доступны углеводы - глюкоза, сахароза и реже фруктоза и мальтоза. Для снижения стоимости питательной среды в качестве источников углерода используют вторич­ное сырье: свекловичную мелассу, молочную сыворотку, гидролизаты крахмала, сульфитные щелока. Технология этого процесса совершен­ствуется в направлении разработки дешевых синтетических питатель­ных сред на основе уксусной кислоты (до 1,5%), пропионовой кислоты, метанола, этанола (до 1 %) и н-парафинов. В качестве источников азота применяют мочевину и соли аммония (сульфаты и фосфаты). Для ус­пешного развития микроорганизмы нуждаются в стимуляторах роста, в качестве которых выступают экстракты кукурузы, дрожжей и солодо­вых ростков, гидролизаты отрубей и дрожжей, витамины группы В. Кроме того, в питательную среду добавляют необходимые для жизнеде­ятельности макро- и микроэлементы (Р, Са, Mg, Mn, Fe и др.). На про­цесс биосинтеза аминокислот существенное влияние оказывает снабже­ние воздухом, при этом степень аэрации индивидуальна для производ­ства каждой конкретной аминокислоты. Стерильный воздух подается специальными турбинными мешалками (рис. 5.1).

Рис. 5.1. Технологическая схема получения кормового препарата лизина:

1. - подача свекловичной мелассы; 2 - водная суспензия кукурузного экстракта и питательных солей; 3 - нагревательная колонка; 4, 5 - теплообменники; 6 - посев­ные аппараты; 7 - подача посевного материала; 8 - система фильтров для очистки и стерилизации воздуха; 9 - ферментер; 10 - фильтры для очистки отходящих газов;

2. - получение монохлоридгидрата лизина; 12 - подача соляной кислоты; 13, 14 - выход и подогрев монохлоридгидрата лизина; 15 - выпаривательная установка; 16 - сборник ЖКЛ; 17 - смешивание ЖКЛ с наполнителем; 18 - распылитель; 19 - пода­ча горячего воздуха; 20 - очиститель воздуха; 21 - отделение сухого препарата ли­зина от воздуха; 22 - приемник ККЛ.

Опыты показали, что лизин появляется в культуральной среде, начиная с середины экспотенциальной фазы роста культуры клеток микроорганизма, и достигает максимума к ее концу. Поэтому на первой стадии технологического процесса формируют биомассу продуцента, которую выращивают в специальных посевных аппаратах в течение су­ток (рН 7,0 - 7,2; температура 28 - 30 °С), а затем подают в производ­ственный ферментер, заполненный питательной средой. Лизин начинает поступать в культуральную жидкость через 25 - 30 ч после начала фер­ментации. По завершении процесса ферментации (через 55 - 72 ч) жид­кую фазу отделяют от культуры клеток микроорганизма фильтрованием и используют для выделения из нее лизина.

Высокоочищенные препараты лизина получают после фрак­ционирования фильтрата культуральной жидкости методом ионо­обменной хроматографии на катионите. С этой целью лизин переводят в форму катиона:

NH3

₊ (CH2)4

h₃n-ch-cooh

Для данного процесса фильтрат обрабатывают соляной кислотой до рН 1,6 - 2,0 (рН < pKj). Обладая двумя положительно заряженными ионогенными группировками, лизин прочно сорбируется на смоле и элюируется с нее в виде индивидуального соединения 0,5 - 5 %-ном раствором гидроксида аммония после выхода всех других катионов. Элюат концентрируют в вакууме при температуре 60 °С, переводят в форму монохлоргидрата, после чего высушивают и дополнительно чи­стят с помощью перекристаллизации. В результате получают препараты кристаллического лизина 97 - 98 %-й чистоты, которые используют для повышения питательной ценности пищевых продуктов и в медицинской промышленности.

Кроме высокоочищенных препаратов лизина получают иные виды его товарной формы: жидкий концентрат лизина (ЖКЛ), сухой кормо­вой концентрат лизина (ККЛ) и высококонцентрированные кормовые препараты, характеризующиеся относительно меньшей степенью очистки в сравнении с первым препаратом.

Получение глутаминовой кислоты

cooh (ch₂)₂ hon-ch-cooh

Глутаминовая кислота - это первая аминокислота, полученная микробиологическим путем. Мутантов, обеспечивающих сверхсинтез этой кислоты, не получено, а «перепроизводство» этой аминокислоты связано с особыми условиями, при которых нарушается синтез мем­бранных фосфолипидов. Глутаминовая кислота синтезируется исключи­тельно культурами Corynebacterium glutamicum и Brevibacterium flavum.

Субстратами для ее получения являются глюкоза и уксусная кис­лота, а в начале 60-х гг. прошлого столетия использовали и н-парафины. Особые условия для роста культур создаются добавлением к культу- ральной жидкости пенициллина, который подавляет синтез клеточной стенки, или уменьшением (по сравнению с оптимальной) концентрации биотина (витамина В₇) в среде, который индуцирует структурно- функциональные изменения в клеточной мембране, благодаря чему уве­личивается ее проницаемость для глутаминовой кислоты, выходящей из клетки в культуральную жидкость. В Японии с помощью селекции вы­делены температурозависимые штаммы бактерий (термофилы), которые продуцируют высокое содержание глутаминовой кислоты при повы­шенных температурах: в таких условиях достигают 50 %-го превраще­ния используемого источника углерода в глутаминовую кислоту.

Натриевая соль глутаминовой кислоты широко применяется в пищевой промышленности для улучшения вкуса продуктов питания в консервированном и замороженном виде.