Глава 4. Генная инженерия

Генная инженерия - это раздел молекулярной генетики, связан­ный с целенаправленным созданием новых комбинаций генетического материала. Основа прикладной генетической инженерии - теория гена. Созданный генетический материал способен размножаться в клетке- хозяине и синтезировать конечные продукты обмена.

Генетическая инженерия возникла в 1972 г. в Станфордском уни­верситете США. Тогда лаборатория П. Берга получила первую реком- бинантную (гибридную) ДНК. Она соединяла в себе фрагменты ДНК фага лямбда, кишечной палочки и обезьяньего вируса SV40.

Генная инженерия - это направление исследований в молекуляр­ной биологии и генетике, конечной целью которых является получение с помощью лабораторных приемов организмов с новыми, в том числе и не встречающимися в природе, комбинациями наследственных свойств. В основе генной инженерии лежит обусловленная последними дости­жениями молекулярной биологии и генетики возможность целенаправ­ленного манипулирования с фрагментами нуклеиновых кислот. К этим достижениям следует отнести установление универсальности генетиче­ского кода, т. е. факта, что у всех живых организмов включение одних и тех же аминокислот в белковую молекулу кодируются одними и теми же последовательностями в цепи ДНК; успехи генетической энзимоло- гии, представившей в распоряжение исследователя набор ферментов, позволяющих получить в изолированном виде отдельные гены или фрагменты нуклеиновой кислоты, осуществлять in vitro синтез фраг­ментов нуклеиновых кислот, объединить в единое целое полученные фрагменты. Таким образом, изменение наследственных свойств орга­низма с помощью генной инженерии сводится к конструированию из различных фрагментов нового генетического материала и введение его в рецепиентный организм, создания условий для его функционирования и стабильного исследования.

4.1. ИССЛЕДОВАНИЕ МОЛЕКУЛ ДНК

За последние годы методы исследования ДНК получили колос­сальное развитие. К самым совершенным методам, с помощью которых изучается ДНК, относятся методы создания молекул ДНК путем соеди­нения последовательностей, имеющих совершенно различное проис­хождение. Получаемый продукт называют рекомбинантной ДНК. Ре- комбинантная ДНК содержит ген (или гены) и вектор. Вектор - это фрагмент ДНК, обеспечивающий размножение гибридной ДНК и синтез конечных продуктов деятельности генетической системы - белков. Ос­новные исследования выполнены на бактериях и вирусах, так как они являются одними из самых простых организмов, иначе их называют клетками «хозяина». Технология рекомбинантной ДНК позволяет полу­чать генетические видоизмененные варианты целенаправленным и строго контролируемым путем.

Каким же образом гены высших организмов могут быть введены в бактериальные клетки? Наиболее распространенным методом генной инженерии является метод получения рекомбинантных ДНК, т. е. со­держащих чужеродный ген, плазмид. Плазмиды представляют собой кольцевые двухцепочечные молекулы ДНК, состоящие из нескольких тысяч пар нуклеотидов. Каждая бактерия, помимо основной, не поки­дающей клетку молекулы ДНК (5 10⁶ пар нуклеотидов), может содер­жать несколько различных плазмид, которыми она обменивается с дру­гими бактериями. Плазмиды являются автономными генетическими, реплицирующими (т. е. размножающимися) в бактериальной клетке не в то же время, что основная молекула ДНК. Хотя на долю плазмид при­ходится лишь небольшая часть клеточной ДНК, именно они несут такие жизненно важные гены для бактерий, как гены лекарственной устойчи­вости. Разные плазмиды содержат различные гены устойчивости к ан­тибактериальным препаратам. Простота устройства плазмид и легкость, с которой они «входят» и «выходят» из бактерий, используется генными инженерами для введения в клетки бактерий генов высших организмов.

Мощным инструментом генной инженерии являются открытые в 1974 г. ферменты - рестрикционные эндонуклеазы, или рестриктазы.

Рестрикция буквально означает «ограничение». Бактерии клетки вырабатывают рестриктазы для разрушения инородной (в первую оче­редь фаговой ДНК), что необходимо для ограничения вирусной инфек­ции. Рестриктазы «узнают» определенные последовательности нуклео- тидов в ДНК (так называемые сайты - участки узнавания) и вносят симметричные разрывы в цепях ДНК на равных растояниях от центра сайта. В результате на концах каждого фрагмента рестриктированных ДНК образуются короткие одноцепочечные «хвосты», которые называ­ются «липкими концами».

Из разных видов бактерий выделено около пятисот различных ре- стриктаз, для которых описаны сайты рестрикции.

4.2. МЕТОДЫ ГЕННОЙ ИНЖЕНЕРИИ

Для получения рекомбинантной плазмиды ДНК одна из плазмид расщепляется выбранной рестриктазой. Гены, которые нужно ввести в бактериальную клетку, выщепляют из ДНК хромосом человека с помо­щью той же рестриктазы, поэтому его «липкие концы» являются ком­плементарными нуклеотидным последовательностям на концах плазми- ды. Ферментом лигазой «сшивают» оба конца ДНК (гена и плазмиды), в результате получается рекомбинантная кольцевая плазмида, которую вводят в бактерию E. coli. Все потомки этой бактерии называются кло­ном и содержат в плазмидах чужеродный ген, способный вырабатывать белок, кодируемый этим геном. Весь процесс получения таких бакте­рий, называют клонированием. Он состоит из последовательных ста­дий (см. рис. 4.1):

1. Рестрикции - разрезания ДНК человека рестриктазой на мно­жество различных фрагментов, но с одинаковыми «липкими» концами. Такие же концы получают при разрезании плазмидной ДНК той же ре- стриктазой.

2. Лигирования - включения фрагмента ДНК человека в плазмиды благодаря сшиванию «липких концов» ферментом лигазой.

3. Трансформации - введения рекомбинантных плазмид в бакте­риальные клетки, обработанные специальным образом - так, чтобы они на короткое время стали проницаемыми для макромолекул. Однако плазмиды проникают лишь в часть обработанных бактерий. Их разде­ляют, используя определенную питательную среду (например, раствор антибиотика). Каждая из трансформированных бактерий размножается и образует колонию из многих тысяч потомков - клон.

4. Скрининга - отбора среди клонов трансформированных бакте­рий тех, которые сохраняют плазмиды, несущие ген человека.

Не всегда удается точно вырезать нужный ген с помощью ре- стриктаз. Многие гены расщепляются этими ферментами на несколько частей или не содержат последовательностей, узнаваемых рестриктаза- ми. Поэтому в ряде случаев процесс клонирования начинают не с выре­зания из хромосом случайных фрагментов ДНК, а с целенаправленного получения нужного гена. Для этого из клеток человека выделяют и- РНК, которая является транскрипционной копией этого гена, и с помо­щью фермента - обратной транскриптазы (ревертазы) - синтезируют комплементарную цепь ДНК, после чего и-РНК, служащая матрицей при синтезе ДНК, уничтожается РНК-азой - специальным ферментом, способным гидролизовать цепь РНК. Оставшаяся цепь ДНК служит матрицей для синтеза обратной транскриптазой (ДНК-полимераза) ком­плементарной второй цепи ДНК. Получаемая двойная спираль ДНК но­сит название к-ДНК (комплементарная ДНК), она соответствует гену, с которого была считана и-РНК. Такая к-ДНК встраивается в плазмиду, которая трансформирует бактерии, и получают клоны, содержащие только выбранные гены человека.

Рис. 4.1. Введение гена в плазмиду Escherichia coli и клонирование этого гена в клетках кишечной палочки

Плазмида E.coli расщепляется рестрикционной эндонуклеазой в специфическом участке в обеих цепях ДНК, так что на концах расщепленной плазмиды располагаются короткие неспаренные последовательности дезоксирибону- клеотидов (ТТАА или ААТТ), т. е. по четыре нуклеотида, в которых основания представлены тимином и аденином.

Ген, который нужно встроить в плазмиду, выщепляют с помощью этой же рестриктазы, так что его концы яв­ляются комплементарными нуклеотидным последовательностям на концах плазмиды (ААТТ и ТТАА).

Обе ДНК (гена и плазмиды) сшивают вместе с помощью лигазы. Затем рекомбинантную плазмиду вводят в клетку E.coli,которая, размножаясь, образует клон, все клетки которог содержат рекомбинантную плазмиду, а поэтому и чужеродный ген. Последний теперь клонирован в клетках кишечной палочки и индуцирует в ней синтез специфиче- скогобелка.