6.1. Методы получения иммобилизованных ферментов

Под иммобилизацией понимают способы трансформации фермен­тов, обеспечивающие возможность их использования в непрерывных процессах. Иными словами, иммобилизация представляет собой вклю­чение фермента в такую среду, в которой для него доступной является лишь ограниченная часть общего объема. Существуют два принципи­ально различных метода иммобилизации ферментов: без возникновения ковалентных связей между ферментом и носителем (физические методы иммобилизации) и с образованием ковалентной связи между ними (хи­мические методы иммобилизации). Каждый из этих методов осуществ­ляется разными способами ( см. рис. 6.1).

Методы иммобилизации ферментов

Физические

t

Химические

I

1

Адсорбция Включение в гель

Инкапсули- Включение рование в липосомы

Ковалентное связывание

Рис. 6.1. Методы иммобилизации ферментов

U. li> I

lb

1 *

Для получения иммобилизованных ферментов используется огромное число носителей, как органических, так и неорганических. Основные требования, предъявляемые к материалам, которые могут быть применены для иммобилизации ферментов, следующие: а) высо­кая химическая и биологическая стойкость; б) высокая механическая прочность (в первую очередь по отношению к истиранию); в) достаточ­ная проницаемость для фермента и субстратов, большая удельная по­верхность, высокая вместимость, пористость; г) возможность получения в виде удобных в технологическом отношении форм (гранул, мембран, труб, листов и т. д.); д) легкое переведение в реакционноспособную форму (активация); е) высокая гидрофильность, обеспечивающая воз­можность проведения реакции связывания фермента с носителем в вод­ной среде; ж) невысокая стоимость. Отсутствие носителей, удовлетво­ряющих одновременно всем этим требованиям, и разнообразие задач, стоящих перед экспериментаторами, обусловливают широкий набор применяемых для иммобилизации материалов.

6.1.1. Физические методы иммобилизации

Методы иммобилизации, при которых фермент связывается с матрицей без образования ковалентных связей, называют физическими. Эти методы можно разделить на две основные группы - адсорбционные и методы механического включения фермента в матрицу. При адсорб­ционной иммобилизации белковая молекула удерживается на поверхно­сти носителя с помощью электростатических, гидрофобных и водород­ных связей, а также дисперсионных взаимодействий. Механическое включение молекул фермента в матрицу предполагает использование поперечно сшитого геля, микрокапсул, волокон, мембран для ультра­

фильтрации и пр. Физические методы иммобилизации в большинстве случаев достаточно просты, быстры и эффективны, в последние годы они развиваются и используются очень широко.

Иммобилизация ферментов адсорбцией:

• На неорганических носителях

В настоящее время широко применяются материалы для носите­лей на основе кремнезема, окиси алюминия и титана. К преимуществам этих материалов можно отнести возможность широко варьировать по­ристость и структуру, а также достаточно сильную адсорбционную спо­собность по отношению к большинству белков.

Гранулированные носители такого рода очень удобны для коло­ночных реакторов различного типа.

Очень распространенный ранее носитель - уголь - в последние годы применялся в основном для ковалентной иммобилизации путем активации поверхностных оксидных групп.

Активированный уголь особенно удобен при работе с фермента­ми, катализирующими реакции с образованием Н₂О₂, поскольку этот носитель эффективно катализирует ее разложение.

В последнее время в качестве носителей для адсорбционной им­мобилизации ферментов все шире применяются минеральные соли, коллоидный кремний, металлы (никель, нержавеющая сталь) и окислы металлов.

• На органических носителях

Основной тип используемых в настоящее время органических но­сителей для адсорбционной иммобилизации - производные природных полисахаридов: целлюлозы и декстрана. В последнее время для адсорб­ционной иммобилизации ряда ферментов были использованы полиами- носахариды: хитин и хитозан. Эти носители эффективно связывают глюкоамилазу, глюкоизомеразу и химотрипсин. Недостатком этого ме­тода иммобилизации является легкая десорбция ферментов при «кис­лых» и «щелочных» значениях рН.

Широко также используются синтетические полимерные адсор­бенты - ионообменные смолы на основе фенолформальдегидных, эпок­сидных, полифенольных и полиакриловых матриц. Способ иммобили­зации прост - перемешивание раствора фермента и полимера при ком­натной температуре и высушивание.

• Сорбция ферментов на носителях смешанного типа

Носители смешанного типа получают нанесением липидных сло­ев (лецитина и холестерина) на твердую подложку (силикагель, сажу). Широко используется также возможность модификации неорганиче­ских адсорбентов-носителей, прививая к их поверхности органические соединения с определенными функциональными группами, например, аминируя их с помощью %-аминопропилтриэтоксисилана.

Иммобилизация ферментов путем включения в гели

В настоящее время для иммобилизации ферментов чаще всего ис­пользуется полиакриламидный гель. Его получают проводя полимери­зацию в присутствии фермента, инициируемую %-облучением (так называемая радиационная полимеризация).

Новый удобный метод иммобилизации ферментов - использова­ние фотополимеризующихся смол. Сущность этого метода заключается в смешивании фотополимеризующейся смолы, содержащей фоточув­ствительные функциональные группы, локализованные на желаемом расстоянии друг от друга, подходящего инициатора и раствора фермен­та с последующим облучением ультрафиолетовым светом в течение не­скольких минут. Преимущества этого метода заключаются в том, что можно приготовить олигомеры с заранее заданными свойствами, а сам процесс иммобилизации протекает в очень мягких условиях. Кроме то­го, получаемым полимерным гелям можно придавать разную форму.

В последнее время получил распространение метод, который можно назвать «двойной иммобилизацией». Смысл этого метода состо­ит в том, что либо в гель включается фермент, уже иммобилизованный на подходящем носителе, либо полимеризация геля с включением фер­ментов проводится в присутствии твердого адсорбента или наполните­ля.

Иммобилизация ферментов микрокапсулированием

Микрокапсулирование является одним из широко применяемых в последнее время методов физической иммобилизации, который, сохра­няя фермент в растворе фактически в нативном состоянии, дает воз­можность использовать его многократно, отделяя фильтрацией от про­дуктов реакции. Оболочка, непроницаемая для фермента и высокомоле­кулярных соединений, находящихся во внешней среде, позволяет в то же время свободно диффундировать через нее низкомолекулярным ве­ществам, например субстратам и продуктам.

В настоящее время существуют три основных метода заключения ферментов в полупроницаемые мембраны: межфазная поликонденса­ция, межфазная коацервация и двойное эмульгирование. При первом методе образование мембраны происходит в ходе химической реакции на поверхности раздела фаз, при втором - мембрана образуется за счет понижения растворимости полимера на границе раздела фаз. Двойное эмульгирование - это модификация метода межфазной коацервации, которая заключается в следующем. Водный раствор, содержащий фер­мент, эмульгируется в растворе полимера (в органическом растворите­ле), затем полученная эмульсия диспергируется в водной фазе с образо­ванием твердых сфер, содержащих водные микрокапли с включенным ферментом. Преимуществами этого метода являются достаточно мягкие условия приготовления биокатализатора, возможность выбора любых значений рН и практическая несжимаемость капсул даже в отсутствии наполнителей.