Тема II. Методы количественного определения белка

Количественное определение белка биуретовым методом

1. В соответствии с табл. 1 готовят ряд разведений исходного раствора белка, содержащего 10 мг бычьего сывороточного альбумина в 1мл.

2. В каждую пробирку, содержащую 0,2-1 мг белка в 1мл, а так же к 1 мл исследуемого образца добавить по 4 мл биуретового реактива.

3. Смеси инкубируют при комнатной температуре в течение 30 минут.

4. Регистрируют оптическую плотность проб на спектрофотометре при  540 (560) нм. В качестве контроля используют раствор, состоящий из 1мл воды и 4 мл биуретового реактива.

5. Строят калибровочный график зависимости оптической плотности от концентрации белка.

6. Концентрацию белка в исследуемом образце определяют по калибровочному графику.

Количественное определение белка по методу Лоури

1. Смешивают 50 мл раствора А и 1 мл раствора Б.

2. В соответствии с табл. 2 готовят ряд разведений исходного раствора белка, содержащего 500 мкг бычьего сывороточного альбумина в 1мл. В каждую пробирку, содержащую 25-500 мкг белка в 1 мл, а так же к 1 мл исследуемого образца приливают по 5 мл смеси растворов А и Б.

3. Содержимое пробирок интенсивно встряхивают и инкубируют в течение 10 минут при комнатной температуре.

4. При постоянном перемешивании в пробирки быстро вносят по 0,5 мл реактива Фолина.

5. Пробирки инкубируют в течение 30 минут.

6. Регистрируют оптическую плотность при =750 нм против контрольной пробы.

7. Строят калибровочный график зависимости оптической плотности от концентрации белка.

8. Концентрацию белка в исследуемом образце определяют по калибровочному графику.

Количественное определение белка по методу Брэдфорд

1. В соответствии с табл. 3 готовят ряд разведений исходного раствора белка, содержащего 100 мкг бычьего сывороточного альбумина в 0,1мл. В каждую пробирку, содержащую 10-100 мкг белка в 0,1 мл и к 0,1 мл исследуемого образца приливают по 5 мл реактива Брэдфорд.

2. Пробы инкубируют в течение 5 минут.

3. Регистрируют оптическую плотность при =595 нм против контроля.

4. Строят калибровочный график зависимости оптической плотности от концентрации белка.

5. Концентрацию белка в исследуемом образце определяют по калибровочному графику.

Оформление работы

К занятию:

1. Изучить и кратко законспектировать теоретический материал по лабораторной работе.

Во время занятия:

2. Описать основные этапы работы.

3. Описать полученные результаты по теме I и сделать выводы.

4. Результаты измерений оптической плотности занести в таблицы (см. ниже).

5. Построить калибровочные графики.

6. Расчитать концентрации белка в исследуемых образцах.

7. Описать полученные результаты по теме II и сделать выводы.

Построение калибровочных графиков Биуретовый метод Таблица 1

№	Концентрация белка, мг/мл	Приготовление пробы (объемом 1 мл)		Оптическая плотность при =540 нм
		Исходный раствор белка №1, мл	Вода, мл
1.	0	0	1
2.	2	0,2	0,8
3.	4	0,4	0,6
4.	6	0,6	0,4
5.	8	0,8	0,2
6.	10	1	0