Методы количественного определения белка

Для количественного определения белка в препаратах применяют химические, физические и биологические методы. Наиболее распространенным химическим методом количественного определения белков является колориметрический метод. Он основан на измерении интенсивности окраски, развивающейся при взаимодействии белков с тем или иным специфическим реагентом. Колориметрия является основой для количественного определения белка биуретовым методом, а также методами Лоури и Брэдфорд.

Метод определения белка по биуретовой реакции является достаточно точным в тех случаях, когда содержание белка в исследуемом образце достаточно велико (не ниже нескольких мг/мл). Специфичность данного метода заключается в том, что биуретовый реагент выявляет пептидные связи (см. лабораторную работу №1). Биуретовая реакция чувствительна к температуре. Ее повышение увеличивает скорость развития окраски. Поэтому для получения воспроизводимых результатов, при количественном определении белка биуретовым методом, анализируемые пробы необходимо инкубировать при одной и той же температуре.

Метод лоури долгое время был наиболее распространенным методом количественного определения белка в силу своей высокой чувствительности. В основе метода лежат две цветные реакции на белок: биуретовая реакция и реакция Фолина на остатки тирозина и цистеина в белковой молекуле. Поэтому метод Лоури позволяет осуществлять определение белков в сильно разбавленных растворах, где их количество выражается десятками микрограммов.

Метод Брэдфорд, в отличие от двух предыдущих, является самым точным и чувствительным. Он основан на способности красителя - Кумасси бриллиантового синего G-250 - существовать в двух цветовых формах: красной и синей. В результате взаимодействия с белком красная форма красителя приобретает синее окрашивание за счет образования комплекса белок-краситель. Комплекс протеин-краситель имеет высокий коэффициент экстинкции, определяющий высокую чувствительность метода. Другим важным преимуществом метода Брэдфорд является быстрое развитие окраски (около 2 мин), поэтому весь анализ занимает непродолжительное время. Метод удобен для серийных анализов и адаптирован к автоматическим анализаторам.

Абсорбционная спектроскопия

Метод абсорбционной (электронной) спектроскопии основан на способности молекул поглощать свет. Длины волн, при которых происходит поглощение света и степень поглощения зависят от структуры и от окружения молекулы вещества, поэтому абсорбционная спектроскопия является важнейшим инструментом характеристики различных низкомолекулярных соединений и макромолекул.

Общая теория поглощения света молекулами

Световая волна состоит из взаимно перпендикулярных электрического и магнитного полей, амплитуды которых, по мере распространения в пространстве, изменяются по синусоиде. Энергия волны, Е, равна:

,

где h – постоянная Планка, c – скорость света,  - длина волны и  - частота.

Когда волна сталкивается с молекулой вещества, она может либо рассеиваться (т.е. изменять направление распространения), либо поглощаться (т.е. передавать энергию молекуле). Относительная вероятность протекания того или иного процесса зависит от свойств той молекулы, с которой произошло столкновение. Если происходит поглощение электромагнитной энергии света, молекула переходит в возбужденное состояние. Молекула или часть молекулы, которая может быть возбуждена посредством поглощения света в видимой или ближней УФ-области, называется хромофором. Обычно энергия возбуждения превращается в тепло в результате столкновения возбужденной молекулы с другой молекулой (например, молекулой раствори­теля). В некоторых случаях энергия вновь излучается (явление флуоресценции). Возбужденная молекула обладает набором дискретных кван­тованных энергетических состояний, описываемых законами квантовой механики. Эти состояния называют энергетическими уровнями молекулы. Главные энергетические уровни определя­ются возможным пространственным распределением электронов и называются электронными энергетическими уровнями; на них накладываются колебательные уровни, которые указывают на различные типы колебаний молекулы (например, растягивание или изменение углов различных ковалентных связей). Энергетические уровни обычно описываются схемой энергетических уровней (см. рис. 3.5). Самый низкий электронный уровень называется основным состоянием, а все другие – возбужденными.

Рис. 3.5 Типичная схема энергетических уровней, показывающая основное состояние (1) и первое возбужденное состояние (2). Тонкими горизонтальными линиями показаны колебательные уровни (3). Длинная стрелка указывает на возможный электронный переход между основным со­стоянием и четвертым колебательным уровнем первого возбужденного состояния. Корот­кая стрелка означает переход с одного колебательного уровня на другой в пределах основного состояния.

Поглощение энергии происходит с наибольшей вероятностью только в том случае, если количество поглощенной энергии соот­ветствует разности энергетических уровней. Это можно выразить следующим уравнением:

,

где Е₁ – энергетический уровень молекулы до поглощения, а E₂ – энергетический уровень, достигаемый в результате погло­щения.

Изменение энергетического состояния при испускании или поглощении кванта называется переходом. Упрощенно переход между электронными энергетическими уровнями соответствует энергии, необходимой для перемещения электрона с одной орбитали на другую. На схеме энергетических уровней переходы изображаются вертикальными стрелками. Зависимость вероятности поглощения от длины волны называется спектром погло­щения. Задача абсорбционной спектроскопии состоит в накоп­лении и анализе данных по поглощению. Если бы все переходы происходили только между самыми низкими колебательными уровнями основного состояния и первого возбужденного состоя­ния, тогда спектр поглощения состоял бы из узких, дискретных линий. Однако, поскольку возможны переходы с основного со­стояния на любой колебательный и вращательный уровни пер­вого возбужденного состояния, а линии имеют конечную ширину, то спектр проявляется в виде относительно плавной кривой. Для большинства молекул длины волн, соответствую­щие переходам между основным состоянием и любым колебательным уровнем первого возбужденного состояния, лежат в ультрафиолетовой и видимой области спектра. Возможны также низкие по энергии переходы между колебательными уровнями в пределах одного электронного уровня. Эти переходы происходят в результате поглощения излучения в инфракрасной области.

Вероятность перехода при одной длине волны характеризует­ся молярным коэффициентом поглощения при этой длине волны. Чтобы определить этот параметр рассмотрим, как он измеря­ется. Если свет интенсивности I₀ проходит через раствор с тол­щиной слоя l и концентрацией вещества C, интенсивность прошедшего све­та I подчиняется закону Бугера-Ламберта-Бера:

I = I₀10 ^{– lC}, то есть – lC или lC,

где  – молярный коэффициент поглощения (экстинкции), измеряемый в моль^–1см^–1, и равный поглощению раствора с концентрацией в 1 М при длине оптического пути в 1 см. Ре­зультаты измерения выражают чаще всего, как поглощение A ( ). Когда l = 1 см, А называют D_ или оптической плотностью, индекс  указывает длину волны, при которой проводится измере­ние. Оптической плотностью удобно пользоваться, так как она равняется ∙С. В некоторых случаях, если С велико,  становится функцией С, и тогда можно сказать, что закон Бера наруша­ется. Это может быть результатом рассеяния света или структур­ных изменений вещества (например, димеризации, аггрегации или химиче­ских изменений) при высоких концентрациях.

Контрольные вопросы

1. Основные принципы строения сложных белков

2. Гемопротеиды: гемоглобин – важнейший представитель гемопротеидов

3. Методы выделения гемоглобина, качественная реакция на гемовую группу

4. Фосфорпотеиды: строение и роль в организме

5. Методика выделения казеина, обнаружение фосфорной кислоты в казеине

6. Абсорбционная спектроскопия

7. Методы количественного определения белка

Литература

1. Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A.L., Randall A.L., Protein measurement with the Folin phenol reagent, J. Biol. Chem., 1951, 193, 265-275

2. Bradford М., A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding, Anal. Biochem., 1976, 72, 248 – 254

3. Овчинников Ю.А., Биоорганическая химия, «Просвещение», М., 1987

4. Марри Р., Греннер Д., Мейес П., Родуэлл В., Биохимия человека, т. 1, «Мир», М., 1993

5. Степанов В.М., Молекулярная биология: структура и функции белков, под ред. академика Спирина А.С., «Высшая школа», М., 1996

6. Кнорре Д.Г., Мызина С.Д., Биологическая химия, «Высшая школа», М., 1998

7. Кольман Я., Рем К.-Г., Наглядная биохимия, «Мир», М., 2000

Ход работы