- •Часть I
- •Содержание
- •Аминокислоты
- •Ионные формы аминокислот
- •Химические свойства аминокислот
- •Реакции аминокислот, обусловленные одновременным присутствием карбоксильных и аминогрупп:
- •Реакции аминокислот, обусловленные присутствием карбоксильных групп:
- •Реакции аминокислот, связанные с присутствием аминогрупп:
- •Методы разделения и идентификации аминокислот
- •Пептиды
- •Тема I.
- •Химические свойства аминокислот.
- •Разделение смеси аминокислот методом хроматографии на бумаге.
- •Тема II.
- •Качественные реакции на аминокислоты.
- •Реакция с формальдегидом
- •Реакция Адамкевича
- •Реакция Гопкинса-Коле
- •Качественные реакции на пептиды и белки.
- •Физико-химические свойства белков
- •Определение изоэлектрической точки белков
- •Реакции осаждения белков
- •Фракционное осаждение белков методом высаливания
- •Сложные белки
- •Гемопротеиды
- •Гемоглобин
- •Выделение гемоглобина
- •Качественная реакция на гемовую группу. Бензидиновая проба
- •Фосфопротеиды
- •Выделение казеина
- •Определение фосфорной кислоты в казеине
- •Методы количественного определения белка
- •Абсорбционная спектроскопия
- •Тема I. Методы выделения белков в гомогенном состоянии
- •Тема II. Методы количественного определения белка
- •Построение калибровочных графиков Биуретовый метод Таблица 1
- •Метод Лоури Таблица 2
- •Метод Брэдфорд Таблица 3
- •Приложение Строение и номенклатура аминокислот
- •Протеиногенные аминокислоты
- •Практикум по общей и экологической биохимии
- •Часть I
- •220009 Минск
Выделение гемоглобина
Гемоглобин является наиболее доступным для лабораторного изучения гемопротеидом. Этот белок выделяют из эритроцитов после их лизиса при добавлении дистиллированной воды, эфира или толуола. В гипотонической среде эритроциты набухают, разрушаются и гемоглобин переходит в водный раствор. Эфир способствует растворению липидной оболочки эритроцитов, что облегчает выход их содержимого в раствор. Отделение белков плазмы достигается их осаждением полунасыщенным раствором сульфата аммония. После центрифугирования раствора и удаления осадка в супернатанте происходит медленная кристаллизация гемоглобина, которую осуществляют в течение длительного времени (около суток) на холоду.
Качественная реакция на гемовую группу. Бензидиновая проба
При добавлении к дефибринизированной крови растворов бензидина и Н2О2 развивается окраска от зеленного до синего тона, что связано с окислением бензидина пероксидом водорода в присутствии гемоглобина. В обычных условиях эта реакция идет крайне медленно, но под действием катализаторов – моментально. Гем обладает каталитической активностью, резко ускоряющей окисление бензидина в присутствии Н2О2. Реакция очень чувствительна и под названием бензидиновой пробы на кровь используется в судебно-медицинской экспертизе.
Фосфопротеиды
Фосфопротеиды – это сложные белки, простетической группой которых является ортофосфорная кислота. Процессы фосфорилирования и дефосфорилирования белков играют важную роль в системах регуляции метаболических путей. Этот механизм позволяет контролировать активность ряда жизненно важных ферментов. Примером может служить гликогенфосфорилаза, катализирующая фосфоролиз гликогена в печени. Фосфорилирование одного из остатков серина обеспечивает активацию этого фермента, при отщеплении фосфатной группы происходит его инактивация. Во многих случаях цикл фосфорилирования/дефосфорилирования белков зависит от аденилатциклазной системы. Известно, что эффекты сАМР связаны с фосфорилированием или дефосфорилированием эукариотических белков. Любое воздействие сАМР на такие разные процессы, как стероидогенез, секреция, транспорт ионов, метаболизм углеводов и жиров, индукция ферментов, регуляция транскрипции генов, рост и деление клеток регулируется активностью специфической протеинкиназы или специфической фосфатазы, либо доступностью субстратов для фосфорилирования. Многие белки, в том числе казеин, гистоны и протамины могут подвергаться фосфорилированию.
Выделение казеина
Наиболее доступным для изучения фосфопротеидом является белок молока – казеин. Вследствие присутствия фосфатной группы он обладает кислыми свойствами и в молоке находится в виде кислой кальциевой соли. Чаще всего казеин выделяют путем подкисления молока. Эта процедура основана на том, что казеин является гидрофобным белком, лишенным гидратной оболочки, поэтому в изоэлектрической точке (слабокислая среда) он становится крайне нестабильным и выпадает в осадок (см. лабораторную работу №2).
Определение фосфорной кислоты в казеине
Обнаружение фосфорной кислоты в образце можно осуществить с использованием молибдата аммония или магнезиальной смеси.
Фосфорная кислота образует с молибденовым реактивом желтый кристаллический осадок фосфорномолибденовокислого аммония:
H3PO4 + 12(NH4)2MoO4 + 21HNO3 → (NH4)3PO4 12MoO3 + 21NH4NO3 + + 12H2O.
Реакция с магнезиальной смесью основана на образовании кристаллического осадка фосфата магний-амония MgNH4PO4 в ходе двух последовательных реакций: образования фосфата аммония и взаимодействия данной соли со смесью хлорида магния и хлорида аммония.