3. Фракционное осаждение белков методом высаливания

Разделение альбуминов и глобулинов яичного белка с использованием сульфата аммония

1. К 1 мл неразбавленного яичного белка приливают 6 мл воды.

2. Для растворения образовавшегося небольшого белого хлопьевидного осадка глобулинов в эту пробирку приливают несколько капель насыщенного раствора сульфата аммония.

3. К 7 мл данного раствора яичного белка, приливают равный объем насыщенного раствора сульфата аммония.

4. Наблюдают выпадение осадка глобулинов, который удаляют фильтрованием.

5. К фильтрату добавляют кристаллический сульфат аммония до полного насыщения.

6. Выпавший при этом осадок альбуминов также отфильтровывают.

7. С фильтратом проделывают пробу на полноту осаждения белка с помощью 5% ТХУ.

Обратимость высаливания

1. К 2 мл 1% раствора белка приливают 2 мл насыщенного раствора сульфата аммония.

2. Далее в пробирку наливают 4 мл воды и встряхивают.

3. Наблюдают, записывают и объясняют результаты.

Разделение альбуминов и глобулинов яичного белка с использованием хлористого натрия и сернокислого магния

1. В две пробирки наливают по 3 мл белка.

2. Прибавляют до полного насыщения в одну пробирку тонко измельченный NaCl, в другую – MgSO₄.

3. Отфильтровывают появившиеся через несколько минут осадки глобулинов.

4. К фильтратам прибавляют по 5 капель 1% раствора уксусной кислоты.

5. Наблюдают выпадение альбуминов, отфильтровывают осадок.

6. Фильтрат проверяют на отсутствие белка при помощи биуретовой реакции.

Оформление работы

К занятию:

1. Кратко законспектировать теоретические материалы к лабораторной работе.

Во время занятия:

2. Описать этапы работы.

3. Описать результаты.

4. Сделать выводы.

Методические указания к лабораторному практикуму по курсу

"Общая и экологическая биохимия"

Раздел "Белки"

Лабораторная работа № 3

Темы:	Сложные белки. Методы выделения белков в гомогенном состоянии
	Методы количественного определения белка. Определение белка неизвестной концентрации
Цель работы:	Овладение методиками и подходами, используемыми при выделении и очистке белков Овладение методами количественного определения белка в биологическом материале: биуретовый метод, методы Лоури и Бредфорд

Оборудование и материалы:

• Спектрофотометр SOLAR

• Центрифуга К-24

• Центрифуга настольная

• Кюветы стекляные

• Термостат

• Баня песочная

• Пипетки стекляные на 1 мл и 5 мл

• Микропипетки автоматические

• Цилиндры мерные на 250 мл и 100 мл

• Колбы емкостью 250 мл и 100 мл

• Пробирки

• Штативы для пробирок

• Бумага фильтровальная

• Индикаторная бумага универсальная

• Бумага миллиметровая

Реактивы:

• Молоко

• Кровь цельная

• Биуретовый реактив

• реактив Брэдфорд

• раствор А (2%-ный Na₂CO₃ в 0,1М NaOH)

• раствор Б (0,5%-ный CuSO₄· 5Н₂О в 1%-ном тартрате натрия (или калия)

• коммерческий реактив Фолина

• Бензидин, раствор

• Перекись водорода (Н₂О₂), 3% раствор

• Молибденовый реактив:

молибдат аммония ([NH₄]₂MoO₄), 15% раствор / HNO₃( конц.) в отнош. 110/ 90

• Гидроксид натрия (NaOH), 5 М раствор

• Карбонат натрия (Na₂CO₃), 0,1% раствор

• Сульфат аммония ([NH₄]₂SO₄), насыщ. раствор

• Эфир диэтиловый

• Спирт этиловый, 96%

• Спирт метиловый

• Хлороформ

• Уксусная кислота, ледяная, 0,1% раствор

• Азотная кислота (HNO₃), конц.

• Серная кислота (H₂SO₄), конц., 10 М раствор

• стандартные растворы белка (БСА) №1, 2, 3

• Растворы белка разных концентраций (исследуемые образцы)

• вода дистиллированная

Теоретическая часть