Тема I. Методы выделения белков в гомогенном состоянии

Выделение и характеристика гемоглобина

Получение кристаллического оксигемоглобина

1. К 10 мл крови приливают 2 мл смеси воды и эфира (1:1) и содержимое перемешивают до полного гемолиза.

2. К полученному гемолизату при перемешивании добавляют равный объем (12 мл) насыщенного раствора сульфата аммония.

3. Выпавший осадок белков удаляют центрифугированием в течение 15 мин при 3000 об/мин или фильтрованием на бумажном фильтре.

4. Полученный супернатант или фильтрат оставляют на холоду в закрытом сосуде в течение суток до появления в растворе призм и пластинок красного цвета.

Бензидиновая проба

1. Три капли дефибринизированной крови разводят водой до 2 мл.

2. К полученному раствору приливают равный объем раствора бензидина и перемешивают.

3. Далее в пробирку добавляют 5 капель 3% раствора перекиси водорода.

4. Записывают наблюдаемые изменения и объясняют результат.

Выделение и характеристика казеина

Выделение казеина из молока

1. 30 мл снятого молока разбавляют четырьмя объемами воды.

2. К полученному препарату при помешивании добавляют по каплям 0.1% раствор уксусной кислоты до прекращения выпадения осадка казеина (избегать избытка кислоты, так как казеин в сильнокислой среде растворяется!).

3. Осадок казеина отфильтровывают и промывают водой.

4. Для отделения жиров и других соединений казеин растворяют в 0.1% растворе карбоната натрия. При этом казеин переходит в раствор, а жиры остаются во взвешенном состоянии.

5. Смесь фильтруют используя влажный фильтр, при этом жиры остаются на фильтре.

6. К фильтрату, представляющему собой раствор натриевой соли казеина снова добавляют 0.1% раствор уксусной кислоты.

7. Полученный осадок казеина отфильтровывают, отжимают между листами фильтровальной бумаги, по возможности, досуха.

8. Подсушенный казеин обезвоживают посредством растирания в ступке с 20 мл спирта.

9. Затем для полного удаления жиров казеин встряхивают в большой пробирке сначала с эфиром, а затем с 20 мл смеси метилового спирта и хлороформа (1:1).

10. Очищеный казеин высушивают на воздухе до получения белого порошка.

Определение остатков фосфорной кислоты в казеине

Приготовление образца:

1. Навеску казеина (0.05 г) смешивают в тугоплавкой пробирке с 0.3 мл (5 каплями) концентрированной серной кислоты и таким же количеством азотной кислоты.

2. Пробирку нагревают в песочной бане. Смесь обугливается и при дальнейшем нагревании приобретает бурую окраску.

3. Через 10 мин, если раствор не обесцвечиватся, добавляют еще 2 капли азотной кислоты и продолжают нагревание. Эту процедуру повторяют до полного обесцвечивания смеси.

4. Затем добавляют 2 мл воды и продолжают нагревание для удаления оставшейся азотной кислоты

5. После этого смесь нейтрализуют используя для контроля индикаторную бумагу. Нейтрализацию осуществляют добавлением по каплям 5 М раствора гидроксида натрия (при добавлении избытка щелочи, ее нейтрализуют 1-2 каплями 10 М раствора серной кислоты).

Реакция открытия фосфорной кислоты молибдатом аммония:

6. К 2 мл молибденового реактива (раствора молибдата аммония в азотной кислоте) прибавляют 1 мл анализируемого раствора.

7. Смесь нагревают до кипения и кипятят 2-3 мин.

8. Записывают наблюдаемые изменения и объясняют результаты.