Примеры ситуационных задач

Задача 1. Токсическое действие аммиака на клетки мозга объясняется, в частности, нарушением образования нейромедиаторов. Синтез какого из известных Вам нейромедиаторов будет нарушен в первую очередь?

Задача 2.Если препарат скелетной мышцы обработан смесью йодацетата (ингибитор глицеральдегиддегидрогеназы) и ротенона (ингибитор цепи переноса протонов и электронов), то мышца теряет способность сокращаться в ответ на электростимуляцию. Если препарат скелетной мышцы обработан только ротеноном, то способность к сокращению сохраняется. Объясните результаты.

Подготовьте к предстоящему занятию протокол лабораторных работ: выпишите кратко принципы методов и техники их выполнения, показатели нормы, оставляя место для расчетов и выводов.

Самостоятельная работа студентов

Работа № 1. Выделение гликогена из мышечной ткани.

Принцип метода. При экстракции используется способность гликогена к растворению в кислой среде. Применение трихлоруксусной или хлорной кислот в качестве экстрагирующего агента одновременно с выделение гликогена дает возможность освободить раствор от примесей белков, нуклеиновых кислот и других полимеров. Гликоген, подобно белкам, обладает резко выраженными гидрофильными свойствами, поэтому его можно легко осадить из раствора путем высаливания солями щелочных и щелочно-земельных металлов, солями тяжелых металлов, этиловым спиртом.

Ход работы. Забить животное, быстро выделить 5 г мышечной ткани и поместить в фарфоровую ступку, вмороженную в лед. Ткань измельчить, залить 2 мл 5% раствора трихлоруксусной кислоты (ТХУ) и растереть пестиком. Добвить еще 3 мл 5% раствора ТХУ и вновь тщательно растереть пестиком. Полученную кашицу отцентрифугировать при 3000 об/мин, после чего перенести в 2 пробирки по 1 мл надосадочной жидкости. С одной из пробирок провести йодную пробу на гликоген, добавив 2-3 капли реактива Люголя. Отметить появление характерной красно-бурой окраски раствора. Во вторую пробирку прилить 1 мл 10% раствора ацетата свинца и отметить выпадение осадка.

Работа № 2. Выделение миоглобина из мышечной ткани.

Ход работы. Красную мышцу животного (2 – 3 г) очистить от жира и соединительной ткани, тщательно измельчить ножницами и залит 15 мл 0,3% раствора аммиака. Полученную смесь оставить на 30 мин при комнатной температуре, периодически перемешивая. Затем профильтровать щелочной экстракт через бумажный фильтр. К фильтрату красного цвета добавить несколько капель концентрированной соляной кислоты. Отметить изменение красной окраски в коричневую, обусловленную переходом гемма ммиоглобина в гемин.

Работа №3. Количественное определение креатинина в моче по Яффе.

Принцип метода. Метод основан на способности креатинина в щелочной среде взаимодействовать с пикриновой кислотой с образованием пикрата креатинина оранжево-красного цвета.

Ход работы. Приготовить опытную пробу: в цилиндр объемом 100 мл внести 0,5 мл мочи и 3 мл насыщенного раствора пикриновой кислоты. Смесь тщательно встряхнуть и добавить 0,2 мл 10% раствора едкого натра, выдержать 10 мин при комнатной температуре и довести дистиллированной водой до 100 мл. Приготовить контрольную пробу: к 3 мл раствора пикриновой кислоты добавить 0,2 мл 10% раствора едкого натра и довести объем смеси дистиллированной водой до 100 мл. Приготовить стандартную пробу: к 0,5 мл стандартного раствора (содержит 8,8 ммоль/л, или 1 г/л креатинина) прилить 3 мл раствора пикриновой кислоты и 0,2 мл 10% раствора едкого натра, выдержать 10 мин при комнатной температуре и довести дистиллированной водой до 100 мл. Интенсивность окраски опытной и стандартной проб измерить на ФЭКе против контрольного раствора в кювете с толщиной слоя 10 мм при зеленом светофильтре.

Расчет: концентрация креатинина (моль/сут) = (Е_оп/Е_ст) × 8,8

Норма: 4,4 – 17,6 моль/сут, или 0,5 – 2 г/сут.

Клинико-диагностическое значение. Содержание креатинина в моче зависит от характера питания, увеличиваясь при употреблении мясной пищи. Повышение его экскреции с мочой наблюдается при усиленной мышечной работе, лихорадочных состояниях, пневмонии авитаминозе Е, тиреотоксикозе и др.; понижение экскреции с мочой наблюдается при мышечной атрофии, лейкемии, амилоидозе почек, голодании.

Работа № 4. Качественная реакция на белки мышц.

Принцип метода. Наличие белка определяют биуретовой реакцией, обусловленной тем, что пептидные группы белка в щелочной среде образуют с Сu²⁺ комплексные соединения фиолетового цвета

Ход работы. Для получения гомогената 500 мг мышечной ткани растереть в ступке с 10 мл дистиллированной воды на протяжении 3-х минут.Взять 2 пробирки, в одну внести 0,5 мл дистиллированной воды (контроль), а во вторую – 0,5 мл гомогената (опыт). В обе пробирки налить по 2 мл биуретового реактива и оставить на 20 минут для развития окраски. Фиолетовое окрашивание в опытной пробирке свидетельствует о наличии белка в гомогенате мышечной ткани.

Работа № 5. Тонкослойная хроматография липидов ткани мозга.

Для исследования взять 250 мг ткани мозга, смешать с 5 – 10 мл свежеприготовленной смеси хлороформа и метанола (2:1), поместить в мерную колбу с притертой крышкой на 25 мл и энергично встряхивать содержимое колбы в течение 3 – 5 мин. Довести объем раствора хлороформ-метаноловой смесью до 25 мл (до метки), перемешать и через 5 – 10 мин отфильтровать через обезжиренный бумажный фильтр в колбочку, выпарить досуха на кипящей водяной бане и растворить осадок в 1 мл хлороформа.

0,01 мл хлороформного экстракта нанести на пластинку с силикагелем на расстоянии 1,5 см от нижнего края. Кроме того, на линию старта на нанести в качестве «свидетелей» на расстоянии 1 см друг от друга хлороформные экстракты холестерина, моно-, ди- и триглицеридов.

Поместить пластинку в камеру так, чтобы ее нижний край был погружен в растворитель, состоящий из смеси гексана, диэтилового эфира и уксусной кислоты в соотношении 73:25:2. Хроматографию проводить в течение 50 мин при комнатной температуре. Затем пластинку вынуть, высушить на воздухе и проявить в специальной камере, опрыскивая из пульверизатора 10% спиртовым раствором фосфорномолибденовой кислоты.

После опрыскивания нагреть пластинку в сушильном шкафу до 80 - 100ºС и отметить появление синих пятен на желтом фоне. Как правило, на хроматограмме обнаруживается 8 пятен, расположенных от линии старта в следующем порядке: 1 – фосфолипиды; 2 – неидентифицированные соединения; 3 – холестерин; 4 – моноглицериды; 5 – диглицериды; 6 - свободные жирные кислоты; 7 – триглицериды; 8 – эфиры холестерина.

Внести в тетрадь схему хроматограммы.

Работа № 6. Определение активности холинэстеразы в головном мозге.

В ткани мозга содержатся специфическая и неспецифическая холинэстеразы. Специфическая – гидролизует ацетилхолин, неспецифическая – помимо ацетилхолина гидролизует бутирил- и бензоилхолины.

Взвесить на торсионных весах 100 – 200 мг ткани серого вещества больших полушарий или коры мозжечка (ферментативная активность сохраняется на холоду в течение 1 – 2 недель). Навеску ткани растереть в ступке в 50-кратном количестве дистиллированной воды до образования равномерно опалесцирующей взвеси. Осадок из раствора перенести в 2 пробирки и добавить по 3 мл дистиллированной воды. В первую - контрольную – добавить 1 мл индикаторно-буферного раствора № 1 (200 мг бромтимолового синего растереть в ступке с 20 мл 0,1 н раствора NaOH). Контрольный раствор перенести в мерную колбу на 1 л, добавить 50 мл 0,1 М раствора борной кислоты в 0,1 М растворе KCl. Содержимое колбы довести до метки свежей дистиллированной водой. Раствор имеет насыщенный синий цвет и рН 8,4, стоек при хранении. Во вторую – опытную - пробирку добавить 1 мл индикаторно-буферного раствлора №2 (к 1,8 мл индикаторно-буферного раствора №1 добавить 0,2 мл 1% раствора ацетилхолина или 0,2 мл 1,57% раствора бутирилхолинйодида, или 1,1% раствора бутирилхолинхлорида. Готовить раствор следует не раньше, чем за 3 часа до опыта).

Обе пробирки поставить в термостат при температуре 38ºС на 15 мин, при необходимости – дольше. В результате ферментативного расщепления субстрата наблюдается постепенное освобождение уксусной/масляной кислоты и изменение окраски индикатора от синего или сине-зеленого в опытной пробирке к желтой.

Эталоны ответов на тесты контроля исходного уровня знаний

Вид 1. А) 2; Б) 4.

Вид 2. А) 1А, В, Д; 2Б, Г. Б) 1В, Г; 2А, Б, Д, Е, Ж, З; 3Б, 4Б, 5Д, 6Д, 7Е, З.

Вид 3. А)5, 4, 7, 2, 6, 1; Б) 4, 3, 8, 7, 2, 5, 1, 6, 4.

Вид 4. А) А (+, +, +); Б) А (+, +, +).