3 курс / Общая хирургия и оперативная хирургия / Nekhaev_A_N_Rychagov_G_P_Prakticheskie_navyki_v_obschey_khirurgii

шесть: три из них являются разновидностями Rh-фактора и три – Hr-фактора. Существуют две классификации указанных антигенов, которые одинаково широко используются в литературе:

●Винера: Rh, rh’, rh”, Hr, hr’, hr”;

●Фишера – Рейса: D, С, Е, d, с, е.

Антигены системы Rh – Hr выявляются у эмбрионов на- чиная с 5–8 недель развития, относятся к липопротеидам, нерастворимы в воде, легко разрушаются под воздействием высокой температуры и при высушивании, передаются по наследству, не меняются в течение жизни, содержатся на мембране эритроцитов, лейкоцитов, тромбоцитов, в жидкостях организма и околоплодных водах. Наиболее частой при- чиной изосерологических конфликтов при гемотрансфузиях и беременности является антиген Rh (D), реже – rh’ (С), еще реже – hr’ (с), затем rh” (Е) и hr” (е). Случаев иммунизации по антигену Нr (d) до настоящего времени не выявлено.

Согласно мнению Фишера и Роже, образование антигенов системы резус контролируется тремя парами аллельных генов Dd, Сс, Ее, которые расположены на двух хромосомах. Каждая из хромосом несет только три гена из шести и лишь один из каждой пары: D или d, С или с, Е или е. Поэтому эритроциты, не содержащие антигены rh’ (С) или rh” (Е), всегда содержат аллельные антигены hr’ (с) или hr” (е) и, наоборот, не содержащие hr’ (с) и hr” (е) – всегда содержат аллельные антигены rh’ (С) или rh” (Е). На эритроцитах указанные антигены образуют одну из 18 возможных комбинаций. Наиболее часто встречающиеся сочетания генов системы резус на наследуемой хромосоме Сdе – 53,2%, СDЕ – 15,8%, сDЕ – 14,5%, сdе – 12,3%.

При гемотрансфузиях следует учитывать, что чаще всего иммунизацию вызывает антиген Rh (D), поэтому при переливании крови необходимо предупредить введение этого антигена реципиенту, у которого его нет. В связи с этим среди реципиентов можно выделить лишь две группы крови: Rh-положительную, к которой относится кровь всех лиц, имеющих на эритроцитах антиген D, и Rhотрицательную, к которой относится кровь всех лиц, не имеющих на эритроцитах антигена D. При таком разделении наличие у реципиента других антигенов системы Rh – Hr не учитывается. Переливая Rh-положительную кровь реципиентам с Rh-положительной кровью и Rh-отрица-

101

тельную кровь реципиентам с Rh-отрицательной кровью, можно предупредить иммунизацию по антигену D и избежать тяжелых постгемотрансфузионных осложнений.

У 1% лиц существуют слабые варианты антигена D, отличающиеся по структуре и количеству экспрессируемых молекул на строме эритроцитов, которые объединены в группу Du и характеризуются сниженной иммуногенностью, вследствие чего выявить их бывает сложно. Подтип Du имеет существенное значение, так как приводит к выработке особых антител, которые могут стать причиной развития резус-несовместимости крови донора и реципиента. При наличии антигенов группы Du кровь реципиентов счи- тается отрицательной, а кровь доноров – положительной.

Если у доноров определить резус-принадлежность по тому же принципу, что и у реципиентов, Rh-отрицательная донорская кровь 2–3% доноров будет содержать в эритроцитах антигены С или Е. В связи с этим к группе доноров с Rh-отрицательной кровью должны относиться только те лица, на эритроцитах которых нет антигенов Rh (D), rh’ (С) и rh” (Е). Доноры же, на эритроцитах которых стандартными сыворотками обнаруживаются антигены Rh (D), rh’ (С), rh”(Е),должныбытьотнесеныкгруппеRh-положительных. Это обстоятельство может иметь существенное значение, так как лицо, на эритроцитах которого обнаруживаются антигены rh’ (С) или rh” (Е), будучи донором, относится к группе Rh-положительной, но, будучи реципиентом, счи- тается Rh-отрицательным, так как не имеет антигена D.

Èç антигенов системы Нr наиболее частой причиной иммунизации является антиген hr’ (с). Все лица с Rh-отрица- тельнойкровьюодновременноявляютсяНr-положительными, так как имеют антиген hr’ (с). Среди лиц с Rh-положитель- ной кровью около 81% имеют антиген hr’ (с) и также счи- таются Hr-положительными, а около 19% не имеют антигена hr’ (с) и считаются Нr-отрицательными. Опасность антигена Нr заставляет предостеречь от трансфузий Rhотрицательной крови реципиентам с Rh-положительной кровью или реципиентам, резус-принадлежность которых не определена, так как можно вызвать иммунизацию или постгемотрансфузионное осложнение по антигену hr’ (с), если больной окажется Нr-отрицательным. При переливании одноименной по резус-фактору крови этой опасности практически нет.

102

Резус-антитела, относящиеся к классу IgG, появляются в результате иммунизации лиц с Rh-отрицательной кровью. Это возможно при гемотрансфузиях Rh-ïîëî- жительной крови или при беременности женщины с ре- зус-отрицательной кровью резус-положительным плодом. Резус-антитела являются неполными, моновалентными и блокирующими, могут фиксироваться к Rh-положитель- ным эритроцитам, не вызывая их склеивания. Они агглютинируют эритроциты только в присутствии коллоидных растворов, протеолитических ферментов или под влиянием антиглобулиновой прецитипирующей сыворотки.

Забор крови для определения группы по системе АВО и Rh-фактору

Для определения группы крови по системе АВО ватным тампоном с антисептиком обрабатывают 4-й палец левой руки и копьем делают прокол мягких тканей в области ногтевой фаланги. Первую появившуюся капельку крови стирают тампоном с антисептиком. Слегка массируя палец, последующие несколько капель крови собирают в лунке планшета.

Для определения резус-принадлежности из локтевой вены в сухую пробирку набирают 5–8 мл крови, которую для образования сгустка отстаивают в течение 30–40 мин при комнатной температуре. Формирование сгустка можно ускорить, поместив пробирку с кровью в термостат или на водяную баню. Для исследования используют свободные эритроциты со дна пробирки. В ряде случаев для определения резус-принадлежности кровь помещают в пробирку с изотоническим раствором натрия цитрата и центрифугируют в течение 1 мин при 1000 оборотов, используя для исследования концентрированную взвесь эритроцитов со дна пробирки. Кровь, взятая для определения антигена системы резус, может храниться в течение 2–3 суток при температуре 4–8 °Ñ.

Определение группы крови по системе АВО

Определение группы крови стандартными сыворотками. Исследование проводят при хорошем освещении и температуре воздуха от 15 до 25 °С на планшетах с лунками,

103

используя активные стандартные изоагглютинирующие сыворотки групп О (I), А (II), В (III) и АВ (IV) двух разных серий с титром не ниже 1:32. Перед исследованием необходимо убедиться, что сыворотки прозрачны, не содержат осадка, имеют достаточный срок годности, правильно расположены в штативе и каждый флакон имеет отдельную маркированную пипетку. На левой стороне планшета пишут

Î(I), в середине – А (II), справа – В (III), а по верхнему краю – фамилию и инициалы пациента. Под соответствующими обозначениями наносят одну-две капли стандартных сывороток двух серий в следующем порядке: слева –

Î(I), в середине – А (II), справа – В (III). Таким образом, на планшете получается шесть капель, которые образуют два ряда. Капли исследуемой крови объемом с булавочную головку помещают рядом с каждой каплей стандартной сыворотки, после чего их осторожно перемешивают отдельными стеклянными палочками. Соотношение объема исследуемой крови и сыворотки должно быть 1 : 10.

Возможна более простая методика. В свободную лунку на планшете наносят одну большую каплю крови, из которой часть забирают уголком предметного стекла и переносят в каплю сыворотки, аккуратно перемешивая. Кровь всякий раз берут новым уголком. После этого планшет осторожно покачивают. По мере наступления агглютинации, но не ранее чем через 3 мин в капли, где наступила агглютинация, добавляют по одной капле 0,9% раствора натрия хлорида и продолжают наблюдение. При наличии агглютинации во всех каплях необходимо контрольное исследование с сывороткой АВ (IV) группы.

Таблица 5.1

Оценка результатов определения групп крови стандартными изогемагглютинирующими сыворотками

Î (I)

104

Окончательная оценка результатов проводится по истечении 5 мин (табл. 5.1):

●отсутствие агглютинации во всех трех каплях указывает на то, что в исследуемой крови нет аглютиногенов А

èВ и она относится к группе О (I);

●агглютинация в каплях с сыворотками О (I) и В (III) указывает на то, что в исследуемой крови имеется агглютиноген А и она относится к группе А (II);

●агглютинация в каплях с сыворотками О (I) и А (II) указывает на то, что в исследуемой крови имеется агглютиноген В и она относится к группе В (III);

●агглютинация во всех трех каплях указывает на наличие в исследуемой крови агглютиногенов А и В, поэтому кровь относится к группе АВ (IV). Однако, учитывая то, что агглютинация со всеми сыворотками возможна также вследствие неспецифической агглютинации, для окончательного заключения необходимо провести контрольное исследование со стандартной сывороткой АВ (IV). Лишь отсутствие агглютинации исследуемой крови с сывороткой группы АВ (IV) позволяет отнести кровь к IV группе.

Определение группы крови двойной реакцией (стандартными сыворотками и стандартными эритроцитами).

Стандартные эритроциты представляют собой 10–20% взвесь свежих нативных эритроцитов или отмытых от консерванта тест-клеток групп О (I), А (II) и В (III) в 0,9% растворе натрия хлорида или цитратно-солевом растворе.

105

На планшет наносят по две капли стандартных сывороток О (I), А (II) и В (III) групп двух серий. Соответственно каждой группе сывороток располагают по одной маленькой капле стандартных эритроцитов О (I), А (II) и В (III) групп. В стандартные сыворотки добавляют по одной капле исследуемой крови, а в стандартные эритроциты – по две капли исследуемой сыворотки. Количество крови должно быть в 8–10 раз меньше, чем сыворотки. Капли перемешивают стеклянной палочкой и, покачивая планшет в руках в течение 5 мин, следят за наступлением агглютинации. Если агглютинация нечеткая, к смеси сыворотки и крови дополнительно добавляют по одной капле 0,9% раствора натрия хлорида, после чего делают заключение о групповой принадлежности исследуемой крови (табл. 5.2).

Таблица 5.2

Оценка результатов определения групп крови двойной реакцией

Определение группы крови моноклональными антителами. С этой целью используют моноклональные антите-

106

ла, полученные с применением гибридомной биотехнологии. Гибридома – это клеточный гибрид, образованный путем слияния клетки опухоли костного мозга (миеломы) с иммунным лимфоцитом и способный к неограниченному росту и синтезу специфических моноклональных антител. Разработаны стандартные цоликлоны анти-А и анти-В. Они представляют собой разведенную асцитическую жидкость мышей, носителей соответствующей гибридомы, в которой содержатся специфические иммуноглобулины, направленные против групповых антигенов А и В человека. Цоликлоны анти-А (розового цвета) и анти-В (синего цвета) выпускаются как в нативной, так и в лиофизированной форме в ампулах по 20, 50, 100 и 200 доз с приложенным растворителем. Среди достоинств моноклональных антител – высокая активность, полная стандартность и более быстрая реакция агглютинации. Цоликлоны не содержат антител иной спецификации и поэтому не вызывают неспецифической агглютинации эритроцитов че- ловека, исключают передачу вирусов гепатита и ВИЧ- инфекции. Методика позволяет отказаться от доноров, кровь которых используют для приготовления стандартных изогемагглютинирующих сывороток. Однако следует помнить, что цоликлоны не выявляют слабые подгруппы крови, содержащие разновидности агглютиногена А, вследствие чего этот метод ограниченно пригоден для использования в клинической практике.

107

Исследование группы крови начинают с нанесения на белый планшет по одной большой капле цоликлонов анти-А и анти-В одной серии под соответствующими надписями анти-А и анти-В. Рядом с ними наносят по одной маленькой капле исследуемой крови, перемешивают и наблюдают в течение 2–3 мин за реакцией агглютинации (табл. 5.3). При подозрении на спонтанную агглютинацию у лиц с группой крови АВ (IV) проводят исследование с добавлением 0,9% раствора натрия хлорида. Дополнительным контролем правильности определения группы крови антителами анти-А и анти-В является моноклональный реагент анти-АВ, в результате реакции с которым наблюдается агглютинация эритроцитов групп А (II), В (III) и АВ (IV) и отсутствует у эритроцитов группы О (I).

Ошибки при определении групповой принадлежности крови

Ошибки при определении групп крови могут быть обусловлены техническими причинами, неполноценностью реагентов и биологическими особенностями исследуемой крови.

Ошибки по техническим причинам:

●слабая освещенность;

●отсутствие маркировки и неправильное расположение реагентов на планшете;

●нарушение соотношения тестовых реактивов и исследуемой крови;

●применение нестандартных и недостаточно чистых планшетов, пипеток и стеклянных палочек;

●преждевременная оценка результатов реакции агглютинации;

●несоблюдение температурного режима реакции агглютинации (менее 15 °С или более 25 °С), в результате чего возможно появление ложной холодовой агглютинации или быстрого высыхания исследуемой капли крови с образованием «монетных столбиков»;

●недобавление физиологического раствора. Эта ошибка может привести к тому, что за специфическую агглютинацию принимают ложную (псевдоагглютинация), под которой подразумевают способность эритроцитов склеивать-

108

ся в «монетные столбики» с сохранением мембран, независимо от их агглютинабельных свойств. В отличие от истинной агглютинации, при которой происходит разрушение мембран эритроцитов, граница между форменными элементами крови хорошо видна под микроскопом. После добавления изотонического раствора натрия хлорида и покачивания планшета агрегаты монетных столбиков, как правило, распадаются. В случае возникновения каких-ли- бо сомнений весь ход реакции наблюдают при слабом увеличении микроскопа, что позволяет легко отличить «монетные столбики» от истинной агглютинации;

●неправильная запись группы крови на бланке или в истории болезни.

Ошибки, обусловленные применением неполноценных реагентов:

●применение стандартных сывороток с титром ниже 1 : 32;

●использование реагентов с истекшим сроком хранения;

●применение реагентов, приготовленных в нестерильных условиях или неправильно консервированных, в результате чего возможно возникновение неспецифической «бактериальной» агглютинации;

●затруднение интерпретации результатов реакции агглютинации при выпадении в осадок фибрина. Это связано с тем, что стандартные сыворотки готовят из плазмы крови путем дефибринирования последней раствором кальция хлорида, поэтому они могут содержать избыточ- ное количество ионов кальция. Для получения правильных результатов исследование крови необходимо повторить, используя для этого тестовые реактивы, приготовленные из нативных сывороток.

Ошибки, обусловленные биологическими особенностями исследуемой крови:

●слабая агглютинабельность эритроцитов – связана с наличием разновидностей агглютиногена А. В этом случае при определении группы крови без исследования сыворотки стандартными эритроцитами на наличие агглюти-

нинов кровь подгруппы А2В (IV) могут определить как группу В (III), а кровь подгруппы А2 (II) – как группу О (I). Для идентификации агглютиногена А2 необходимо повторить исследование с другими сериями реагентов, используя другую лабораторную посуду с увеличением времени

109

наблюдения реакции. Специфическими реагентами уточ- нения группы крови методом прямой реакции при нали- чии слабых вариантов антигена А является цоликлон анти-Аñë и реагент анти-А1. Следует помнить, что при некоторых патологических состояниях (онкологические и хронические инфекционные заболевания, болезни крови) также наблюдается слабая агглютинабельность эритроцитов. В этой ситуации для исключения ошибки следует четко соблюдать условия и время реакции;

● неспецифическая агглютинация (панагглютинация) –

это способность эритроцитов агглютинироваться сыворотками всех групп, включая АВ (IV) и сыворотку собственной крови. Неспецифическая агглютинация у 0,07% здоровых людей обусловлена сенсибилизацией эритроцитов тепловыми или холодовыми аутоантигенами. Она наблюдается также при некоторых инфекционных заболеваниях, сопровождающихся септицемией (феномен Томсена), при болезнях крови, спленомегалии, циррозе печени, ожогах и онкологических заболеваниях. При возникновении неспецифической агглютинации необходимо проверить, происходит ли агглютинация тестируемой крови в стандартной сыворотке группы АВ (IV) и изотоническом растворе натрия хлорида. Группа крови при панагглютинации может быть определена после трехкратного отмывания эритроцитов теплым физиологическим раствором (37 °С – при наличии холодовых или 56 °С – при наличии тепловых аутоантигенов). Во избежание ошибок не следует допускать определения группы крови при температуре ниже 15 °С, так как изоагглютинины α и β относятся к холодовым антителам.

Для устранения неспецифической агглютинации планшет на 5 мин помещают в термостат при температуре 37 °С, под влиянием которой неспецифическая агглютинация исчезает, а истинная остается. Целесообразно повторить определение с использованием моноклональных антител. В случае отсутствия эффекта от отмывания эритроцитов необходимо провести повторное взятие образца крови в предварительно согретую пробирку, поместив ее в термоконтейнер для поддержания температуры на уровне 37 °С. Определение группы крови производят при температуре 37 °С, для чего используют предварительно подогретые реактивы, изотонический раствор натрия хлорида и планшет;

110