Статистическаяобработкарезультатовисследования.
ДляобсчетарезультатовиспользовалисьданныереакцииПЦРвреальномвременисоследующимипараметрами:эффективностьпраймероввреакцииПЦРвреальномвременинеменее95%;коэффициенткорреляциинеменее0,99;наклонкривой(slope)-3,4±0,2.
Обработкурезультатовполимеразнойцепнойреакциипроводилиметодом2-ΔΔCT,которыйпоказывает,восколькоразизменяетсяэкспрессиягенавпораженномобразцепосравнениюснепораженным.ΔΔCtрассчитывалоськакΔΔCt=ΔCt(пораженнойкожи)–ΔCt(непораженнойкожи)икаждоезначениеΔCt=Ct(исследуемыйген)–Ct(GAPDH).Экспериментыпроводиливтрехкратнойповторностидлякаждогообразца[Livaketal.,2001].
ОценкасниженияиндексаактивностиочаговойсклеродермииmLoSSI,атакжеотдельноизмененийиндексовэритемыитолщиныочаганамоментпосещениядля4разныхвременныхотметок(первичныйвизит,повторныепосещениячерез4недели,8недельи12недель)проводиласьспомощьюнепараметрическогометодаФридманаидвухфакторногодисперсионногоанализа(two-wayANOVA).СтатистическийанализданныхосуществлялсяспомощьюпрограммSPSSv.21иPrism6Graphpad.МетодФридманаприменялсявсвязиснебольшимколичествомиспытуемых,атакжепосколькунельзябылоподтвердитьдопущениеонормальностираспределения.Достовернымисчиталисьразличияприp<0.05.ПриобщейдостоверностирезультатовпроводилисьапостериорныесравненияспомощьюкритерияВилкоксона.КритическийуровеньзначимостиопределялсяспомощьюпоправкиБонферронидляучетапотенциальногоувеличениявероятностисовершенияошибки1рода.Дляданногоисследованиякритическийуровеньαсоставил0,0125.Нарисункахивтаблицахприведенысреднеарифметическиезначенияпоказателей,вкачестверазбросаэкспериментальныхданныхуказанысреднеквадратичныеотклонения.
Глава3.Результатыисследования
ОсобенностиэкспрессиигеновсистемыAp-1упациентовсочаговойсклеродермией
ВнастоящемразделеприведенырезультатыопределенияэкспрессиигеновсистемыAP-1убольныхочаговойсклеродермиейспомощьюколичественнойметодикиПЦРсдетекциейпродуктовамплификации«врежимереальноговремени».Висследованиебыливключены20образцовкожи,полученныеизсклеродермическихочаговпутемпункционнойбиопсии.Вкачествеконтроляиспользовалисьобразцыкожитехжепациентов,взятыенарасстоянии3смотпатологическогоочагавпределахнепораженнойткани.Большойинтереспредставлялосравнениеуровнейэкспрессиигеноввпораженнойчастикожибольныхсклеродермиейпоотношениюквизуальнонепораженнойчастикожи.Такоесравнение,принятоеиврядезарубежныхлабораторий,позволяетмаксимальноисключитьвлияниепобочныхфакторовначистотуэксперимента[Kulskietal.,2005].
Проанализироваврядстатейибазданных,былсделанвывод,чтовисследованныхпроцессах,играющихважнуюрольвразвитиисклеродермии,вкачествеосновныхтранскрипционныхфакторовприсутствуютпреимущественнокомпонентыфактораАР-1.КомпонентытранскрипционногокомплексаAP-1могутявлятьсягенами-кандидатамиприсклеродермиипоследующимпричинам.Известно,чтотранскрипционныйфакторAP-1представляетсобойгруппупарныхкомплексов,образованныхДНК-связывающимибелками,входящимивсемействаJun,FosиATF(Activatingtranscriptionfactor).ФакторAP-1обеспечиваетответклетокнадействиеростовыхфакторов,цитокинов,нейротрансмиттеровидругихмежклеточныхсигнальныхмолекул.ВрегуляцииактивностиAP-1участвуютG-белки,адаптерныебелки,MAP-киназыидругиекомпонентывнутриклеточныхрегуляторныхсистем[ТурпаевК.Т.идр.,2006].ТранскрипционныйфакторАР-1участвуетвподдержаниибазальногоуровняэкспрессиимногихгенов.Онявляетсяоднойизглавныхмишенейдляиндукцииколлагена1типа[Choetal.,
2006].Егофункциитесносвязаныспроцессамипролиферацииитрансформацииклеток.Индукцияклеточнойдифференцировкивызываетактивациютранскрипциигенов,кодирующихкомпонентыкомплексаАР-1[ТурпаевК.Т.идр.,2006].КлассическийфакторАР1,состоящийизбелковJunиFos,узнаетконсенсуснуюпоследовательностьTGACTCA,встречающуюсявпромоторахмножествагенов.
Былпроизведенанализэкспрессииследующихгенов,кодирующихтранскрипционныйфакторАР-1:C-JUN,JUNB,JUND,C-FOS,FOSB,FRA-1,FRA-2,атакжеATF-1,ATF-3иATF-4.ДляанализаэкспрессииданныхгеновопределялисьуровнимРНКсоответствующихтранскрипционныхфактороввбиоптатахкожиупациентовсочаговойсклеродермией.
Прииндивидуальноманализекаждогобольногобылопоказано,чтоуровеньэкспрессиигенаC-FOSвпораженнойсклеродермиейкожеповышенотносительновизуальнонепораженнойкожи(контроль)винтервалеот1,1раз(больной5)до9.7раз(больной3).Минимальноеизменениеэкспрессиигенаотмечалосьубольногосединичнойбляшкойнастадиисклероза,расположеннойнакожеспины.Максимальноеувеличениеэкспрессииотмечалосьубольногоснесколькимибляшками,расположенными,однаковпределаходнойанатомическойобласти,вколичестве3.Взаимосвязьмеждустепеньюувеличенияуровняэкспрессиигенаираспространенностьюпроцессаотсутствовала(табл.9).Среднеезначениеизмененияуровняэкспрессиигенаоказалосьповышеннымв3.9±2.65раз(рис.2).Упациентов5и8изменениеэкспрессиивпораженнойкожедостовернонеотличаетсяотэкспрессиивнепораженнойкоже.
Таблица9Распределениепоказателястепениизмененияэкспрессиигенас-Fosвзависимостиотразличныхклиническихформ(Б-бляшечная,Г-
генерализованная)
номерпробы |
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
7 |
8 |
9 |
10 |
формазаболевания |
Б |
Г |
Б |
Б |
Б |
Б |
Г |
Б |
Г |
Б |
степеньизмененияэкспрессии |
2.36 |
1.46 |
9.71 |
4.05 |
1.1 |
4.36 |
7.4 |
1.25 |
3.4 |
1.44 |
номерпробы |
11 |
12 |
13 |
14 |
15 |
16 |
17 |
18 |
19 |
20 |
формазаболевания |
Б |
Б |
Г |
Б |
Б |
Б |
Г |
Г |
Б |
Б |
степеньизмененияэкспрессии |
6.27 |
1.21 |
2.24 |
8.9 |
5.68 |
1.24 |
2.68 |
6.3 |
4.27 |
3.09 |
Рис.2.УровеньсодержаниямРНКгенаC-FOSвпораженнойкожепациентовпоотношениюкуровнюсодержанияввизуальнонепораженнойсклеродермиейкоже,принятомуза1
УровеньэкспрессиигенаC-JUNвпораженнойсклеродермиейкожеповышенотносительновизуальнонепораженнойкожи(контроль)винтервалеот1.2раз(больной20)до7.64раз(больная15,фотография8).Иминимальное,имаксимальноеувеличениепоказателейэкспрессиигеновнаблюдалосьупациентовсбляшечнойсклеродермиейсочагаминастадииэритематозныхпятен,приэтомотсутствовалазависимостьотстепениувеличенияэкспрессииираспространенностипроцесса(табл.10).
Среднеезначениеизмененияуровняэкспрессиигенаоказалосьповышеннымв3.6±1.76раза(рисунок3).
Таблица10Распределениепоказателястепениизмененияэкспрессиигенас-Junвзависимостиотразличныхклиническихформ(Б-бляшечная,Г-
генерализованная)
номерпробы |
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
7 |
8 |
9 |
10 |
формазаболевания |
Б |
Г |
Б |
Б |
Б |
Б |
Г |
Б |
Г |
Б |
степеньизмененияэкспрессии |
2.21 |
3.4 4 |
1.44 |
6.34 |
4.38 |
4.9 |
5.3 |
4.73 |
1.72 |
2.08 |
номерпробы |
11 |
12 |
13 |
14 |
15 |
16 |
17 |
18 |
19 |
20 |
формазаболевания |
Б |
Б |
Г |
Б |
Б |
Б |
Г |
Г |
Б |
Б |
степеньизмененияэкспрессии |
4.37 |
1.5 1 |
1.95 |
4.69 |
7.64 |
3.29 |
2.932 |
4.22 |
4.16 |
1.2 |
Фотография8.Пациенткасбляшечнойформойочаговойсклеродермии,укоторойотмечалосьмаксимальноеувеличениеэкспрессиигенас-Junвочагах
Рис.3.УровеньсодержаниямРНКгенаC-JUNвпораженнойкожепациентовпоотношениюкуровнюсодержанияввизуальнонепораженнойсклеродермиейкоже,принятомуза1
ПриизмеренииуровняэкспрессиигенаFRA-1впораженнойсклеродермиейкожеотносительновизуальнонепораженнойкожибылопоказанопонижениевинтервалеот-1,78раз(больной11)до-11,8раз(больная13).
Максимальноеуменьшениеэкспрессиигенаотмечаласьупациенткисгенерализованнойформойочаговойсклеродермиииобширнымиэритематознымиочагаминастадиииндурации(фотография9).