- •Список сокращений
- •Оглавление
- •Глава 2. Материалы и методы исследования 29
- •Глава 3. Получение криоконсервированной культуры эмбриональных клеток свиной печени для ксенотрансплантации 41
- •Глава 4. Оценка эффективности ксенотрансплантации криоконсервированной культуры клеток эмбриональной печени в коррекции острого токсического повреждения печени 54
- •Глава 5. Структурная оценка влияния ксенотрансплантации культуры эмбриональных клеток печени 69
- •Введение
- •Применение клеток печени для коррекции острой печеночной недостаточности (обзор литературы)
- •1.1 Способы клеточной метаболической поддержки в коррекции печеночной недостаточности
- •1.2. Способы коррекции острой печеночной недостаточности в эксперименте
- •1.2.1. Моделирование острой печеночной недостаточности
- •1.2.2. Механизмы острого токсического повреждения печени при введении сСl4
- •1.2.3.Критерии эффективности метаболической клеточной коррекции опн
- •1.3. Трансплантация гепатоцитов в коррекции острой печеночной недостаточности
- •1.3.1. Способы приготовления гепатоцитов для трансплантации
- •1.3.2. Криоконсервация
- •1.3.3.Приготовление препарата для ксенотрансплантации
- •1.3.4. Способы ксенотрансплантации
- •Глава 2. Материалы и методы исследования
- •2.1 Общая характеристика экспериментального материала
- •2.2.2.1. Культура клеток печени
- •2.2.2.2. Приготовление ткани плаценты для ксенотрансплантации
- •2.2.2.3.Приготовление питательной среды для инъекции
- •2.2.3. Методы лабораторного контроля
- •2.2.3.1.Определение массы печени
- •2.2.3.2.Определение биохимических показателей сыворотки крови
- •2.2.3.3.Исследование показателей системы гемостаза
- •2.2.4.Методы морфологического исследования
- •2.3.Методы статистической обработки
- •Глава 3. Получение криоконсервированной культуры эмбриональных клеток свиной печени для ксенотрансплантации
- •3.1.Технология получения культуры клеток печени
- •3.1.1 Дезагрегация печеночной ткани
- •3.1.2. Оптимизация рН среды для культивации клеток
- •3.1.3 Очистка и культивирование эмбриональных клеток свиной печени
- •3.2.Консервация клеток
- •3.2.1. Приготовление среды для криоконсервации
- •3.2.2. Сравнительная оценка эффективности криоконсервации культуры эмбриональных клеток свиной печени
- •3.3. Получение препарата и ксенотрансплантация
- •Глава 4. Оценка эффективности ксенотрансплантации криоконсервированной культуры клеток эмбриональной печени в коррекции острого токсического повреждения печени
- •4.1.Течение острого токсического повреждения печени на фоне метаболической коррекции
- •4.1.1. Ход эксперимента
- •4.1.2. Летальность в экспериментальных группах
- •4.2. Динамика биохимических показателей при остром токсическом повреждении печени под влиянием ксенотрансплантации криоконсер-вированной культуры эмбриональных клеток печени
- •4.2.1. Уровень альбумина в сыворотке крови
- •4.2.2. Уровень холестерина
- •4.2.3. Уровень билирубина
- •4.2.4. Активность индикаторных ферментов
- •4.3. Динамические изменения некоторых показателей системы гемостаза
- •4.3.1. Уровень фибриногена в плазме крови
- •4.3.2. Вязкость крови
- •4.3.3. Гематокрит
- •4.3.4. Агрегация тромбоцитов
- •Глава 5. Структурная оценка влияния ксенотрансплантации культуры эмбриональных клеток печени
- •5.1. Морфологическое исследование зоны трансплантации
- •5.2. Макроскопическая характеристика печени животных
- •5.3. Характеристика строения печени при световой микроскопии
- •5.4. Ультраструктура гепатоцитов при остром токсическом повреждении печени, корригированном ксенотрансплантацией культуры эмбриональных клеток печени
- •5.5. Содержание днк в ядрах гепатоцитов
- •Заключение
- •Практические рекомендации
- •Список использованной литературы
2.2.2.1. Культура клеток печени
Культуру эмбриональных клеток печени получали от плодов свиньи 2-2,5 месячного срока внутриутробного развития. Плоды забирали на мясокомбинате при вынужденном убое супоросных свиноматок. С соблюдением условий асептики беременные матки транспортировали в операционную вивария сразу после забора. Все манипуляции по выделению культуры клеток печени проводили в асептических условиях (использовали ламинарный бокс, антисептики, кварцевание). Извлеченные из матки плоды тщательно отмывались стерильным физиологическим раствором в количестве 500-1000 мл. Забор биоматериала проводили по методике G.Starke [56].
Вскрывали брюшную полость плода, в рану выводили печень, вводили в печеночную артерию раствор коллагеназы (50 мг в 20 мл раствора Хенкса). Сосуды пережимали, печень вправляли в полость брюшины. После экспозиции в 5 минут орган иссекали. Выделенный в стерильных условиях биоматериал доставляли для дальнейших манипуляций в лабораторию во флаконе с питательной средой 199 с добавлением антибиотиков (пенициллин в дозе 1000 ед\мл и стрептомицин в дозе 1000 мкг\мл). Клетки получали комбинированным методом дезагрегации. За основу был взят метод M.Berry (1969) [83], принцип которого заключается в ферментативной и механической обработке ткани. Печень переносили в чашку Петри и инфильтрировали раствором коллагеназы (2,5 мг/1 г массы печени). Чашки помещали в термостат на 10 мин. при t 37о C. После этого печень механически измельчали до получения фрагментов 0,05-0,1 мм, удаляли соединительнотканные элементы. Далее клетки отмывали посредством трехкратного центрифугирования при 700 об/мин с экспозицией 2 мин. Следующим этапом была очистка клеток в фиколловом градиенте (10-20%).В каждую пробирку с тканевой взвесью добавляли фиколл в уменьшающейся концентрации (1г фиколла в 10 мл раствора Хенкса; 2,1г\10 мл; 2,5г\10мл; 2,8г\10мл) по 1 мл. Центрифугировали 15 мин при 1000 об\мин и 20оС. Добивались удаления клеточного детрита, элементов крови, гемопоэтических клеток эмбриональной печени, крупных фрагментов.
Взвесь микрофрагментов собирали пипеткой из всех пробирок и отмывали средой RPMI. Для контроля стерильности из пробирки брали надосадочную жидкость на бактериологический посев [56]. Посчет клеток проводили с помощью теста на исключение красителя [35].
В суспензию клеток добавляли водный раствор красителя (0,4% трипановый синий) и в камере Фукса-Розенталя подсчитывали число неокрашенных и окрашенных клеток в отдельности.
Культивирование выделенных клеток проводили в матрацах Ру с использованием стандартных питательных сред и добавок, производимых фирмой "Вектор" по методу Р.Фрешни [35]. Поверхность культуральной посуды покрывали фибронектином и желатином. Для снятия культуры клеток со стенок посуды применяли версен 0,2 г\л раствора Хенкса по методике Р.Адамса (1983) [3, 76].
Полученные клетки центрифугировали в течение 30 с при 1500 об\мин, после удаления надосадочной жидкости в клеточную взвесь добавляли среду консервации, приготовленную по оригинальной прописи (заявка на изобретение "Среда для криоконсервации клеток печени"; приоритетная справка N 98117042 \ 20 (018599) от 19.11.1998) до концентрации 0,5-2,0 х106 клеток в 1 мл суспензии. Оценку жизнеспособности клеток проводили с помощью теста "на исключение красителя" (трипановый синий) путем подсчета числа неокрашенных клеток в камере Фукса-Розенталя по методу Р.Фрешни. Полученную cуспензию клеток разливали по полиэтиленовым ампулам объемом 4,5 мл. Охлаждение материала проводили поэтапным методом по методике М.С. Маргулиса (1992) [45].
Консервированные клетки хранили в атмосфере жидкого азота в течение 2 мес. Ампулы с клетками отогревали на теплой водяной бане при температуре + 41о С. После вскрытия ампул в асептических условиях оценивали жизнеспособность клеток вышеуказанным способом. Для ксенотрансплантации использовали взвесь полученного материала с содержанием не менее 80% жизнеспособных клеток. Суспензию культуры клеток печени в концентрации 2х106 в 1 мл вводили путем подкожной инъекции в область передней брюшной стенки.