1.3.2. Криоконсервация

Применение жизнеспособных криоконсервированных печеночных клеток может позволять трансплантацию в течение короткого времени и клетки от одного донора могут быть пересажены нескольким реципиентам [160, 167, 213]

Долгосрочное хранение клеток в замороженном состоянии проводят в средах , содержащих криопротекторы [14, 45, 102].

Присутствие криопротектора снижает интенсивность процессов вымораживания воды из клеток и стабилизирует концентрацию вне- и внутриклеточных ионов. В то же время, при размораживании после криоконсервации внутриклеточный протектор выступает в роли повреждающего фактора, если не приняты меры по его удалению из клеток. Удаление консерванта основано на постепенном его выведении из клеток путем отмывания и многократного центрифугирования с растворами понижающейся осмотичности [9, 14, 28, 33].

Наибольшее распространение получила среда для криоконсервации гепатоцитов, содержащая в качестве криопротектора 20% раствор ДМСО. Соотношение криопротектора с количеством взвеси гепатоцитов было 1:1, а жизнеспособность клеток после заморозки и оттаивания составляла 89 %, а после хранения 60 дней - 65,4% [45].

Следует отметить, что эмбриональные клетки после криоконсервации сильнее повреждаются, чем ГЦ, полученные от взрослых доноров [7]. Синусоидальные эндотелиальные клетки печени более чувствительны к холодовому повреждению; их гибель предшествует апоптозу ГЦ и обусловливает это событие [153]. В связи с этой особенностью, исследователи стали использовать для криоконсервации эмбриональных клеток криопротектор поливинилпирролидон. При этом жизнеспособность клеток после заморозки и оттаивания составляла 86%, а после кроиконсервации в течение 12 часов - 68% [36].

Поливинилпирролидон - это внеклеточный криоконсервант [9], который защищает клетки при замораживании и оттаивании, препятствуя их повреждению кристаллами льда и не оказывая на них токсического влияния. Кроме этого, поливинилпирролидон является иммуностимулятором и обладает антитоксическим действием [32].

Для эффективной консервации необходимо учитывать влияние таких факторов, как вид и концентрация криопротектора, время экспозиции, скорость замораживания и оттаивания, температура адаптационного периода, рН раствора, концентрация калия [41, 43].

Криоконсервация культуры ГЦ вызывает выраженные нарушения внутри- и внеклеточного содержания ионов Na+ и K+ [116].

Развитие цитолиза совпадает с динамикой освобождения внутриклеточного калия и изменения рН среды. Показана связь между чувствительностью клеток к холодовой ишемии и изменениями кислотности среды криоконсервации. Наибольшие различия в характере ответа клетки на холодовое воздействие в условиях различной кислотности проявлялись к моменту максимального истощения ее по калию [51].

Несмотря на сообщения об эффективных способах криоконсервации клеток печени в эксперименте, существующие методы требуют доработки, что заставляет многих авторов продолжать поиск новых сред и методик [76, 242, 244].

1.3.3.Приготовление препарата для ксенотрансплантации

Для оптимального восстановления жизнеспособности клеток после длительного хранения при низкой температуре, необходима высокая скорость их размораживания [35].

Как правило, жизнеспособность размороженных клеток оценивают по результатам теста «на исключение красителя», основанного на окраске девитализованных клеток трипановым синим в мазке [29, 39]

Объем ГЦ для трансплантации

В экспериментах на крысах оценивают эффективность метаболической поддержки при трансплантации ГЦ в объеме 2 х 10⁶ [118, 147, 238, 240 ]

Большие дозы аллогенных ГЦ (пересадка в селезенку 1,75 х 10⁸ клеток в три приема) способствуют репопуляции печени у грызунов [204].

В опытах на крупных лабораторных животных (свиньи) оценивают эффективность пересадки 2-10 х 10⁹ клеток [217].