- •Список сокращений
- •Оглавление
- •Глава 2. Материалы и методы исследования 29
- •Глава 3. Получение криоконсервированной культуры эмбриональных клеток свиной печени для ксенотрансплантации 41
- •Глава 4. Оценка эффективности ксенотрансплантации криоконсервированной культуры клеток эмбриональной печени в коррекции острого токсического повреждения печени 54
- •Глава 5. Структурная оценка влияния ксенотрансплантации культуры эмбриональных клеток печени 69
- •Введение
- •Применение клеток печени для коррекции острой печеночной недостаточности (обзор литературы)
- •1.1 Способы клеточной метаболической поддержки в коррекции печеночной недостаточности
- •1.2. Способы коррекции острой печеночной недостаточности в эксперименте
- •1.2.1. Моделирование острой печеночной недостаточности
- •1.2.2. Механизмы острого токсического повреждения печени при введении сСl4
- •1.2.3.Критерии эффективности метаболической клеточной коррекции опн
- •1.3. Трансплантация гепатоцитов в коррекции острой печеночной недостаточности
- •1.3.1. Способы приготовления гепатоцитов для трансплантации
- •1.3.2. Криоконсервация
- •1.3.3.Приготовление препарата для ксенотрансплантации
- •1.3.4. Способы ксенотрансплантации
- •Глава 2. Материалы и методы исследования
- •2.1 Общая характеристика экспериментального материала
- •2.2.2.1. Культура клеток печени
- •2.2.2.2. Приготовление ткани плаценты для ксенотрансплантации
- •2.2.2.3.Приготовление питательной среды для инъекции
- •2.2.3. Методы лабораторного контроля
- •2.2.3.1.Определение массы печени
- •2.2.3.2.Определение биохимических показателей сыворотки крови
- •2.2.3.3.Исследование показателей системы гемостаза
- •2.2.4.Методы морфологического исследования
- •2.3.Методы статистической обработки
- •Глава 3. Получение криоконсервированной культуры эмбриональных клеток свиной печени для ксенотрансплантации
- •3.1.Технология получения культуры клеток печени
- •3.1.1 Дезагрегация печеночной ткани
- •3.1.2. Оптимизация рН среды для культивации клеток
- •3.1.3 Очистка и культивирование эмбриональных клеток свиной печени
- •3.2.Консервация клеток
- •3.2.1. Приготовление среды для криоконсервации
- •3.2.2. Сравнительная оценка эффективности криоконсервации культуры эмбриональных клеток свиной печени
- •3.3. Получение препарата и ксенотрансплантация
- •Глава 4. Оценка эффективности ксенотрансплантации криоконсервированной культуры клеток эмбриональной печени в коррекции острого токсического повреждения печени
- •4.1.Течение острого токсического повреждения печени на фоне метаболической коррекции
- •4.1.1. Ход эксперимента
- •4.1.2. Летальность в экспериментальных группах
- •4.2. Динамика биохимических показателей при остром токсическом повреждении печени под влиянием ксенотрансплантации криоконсер-вированной культуры эмбриональных клеток печени
- •4.2.1. Уровень альбумина в сыворотке крови
- •4.2.2. Уровень холестерина
- •4.2.3. Уровень билирубина
- •4.2.4. Активность индикаторных ферментов
- •4.3. Динамические изменения некоторых показателей системы гемостаза
- •4.3.1. Уровень фибриногена в плазме крови
- •4.3.2. Вязкость крови
- •4.3.3. Гематокрит
- •4.3.4. Агрегация тромбоцитов
- •Глава 5. Структурная оценка влияния ксенотрансплантации культуры эмбриональных клеток печени
- •5.1. Морфологическое исследование зоны трансплантации
- •5.2. Макроскопическая характеристика печени животных
- •5.3. Характеристика строения печени при световой микроскопии
- •5.4. Ультраструктура гепатоцитов при остром токсическом повреждении печени, корригированном ксенотрансплантацией культуры эмбриональных клеток печени
- •5.5. Содержание днк в ядрах гепатоцитов
- •Заключение
- •Практические рекомендации
- •Список использованной литературы
Глава 4. Оценка эффективности ксенотрансплантации криоконсервированной культуры клеток эмбриональной печени в коррекции острого токсического повреждения печени
Поскольку условия эксперимента предполагали индукцию молниеносной ОПН введением ЧХУ в LD100, рассмотрим ход первой серии экспериментов на всем протяжении. Длительность исследования – 6 суток – определялась классическими данными об ожидаемой летальности при отсутствии лечебного воздействия.
4.1.Течение острого токсического повреждения печени на фоне метаболической коррекции
4.1.1. Ход эксперимента
Введение животным ЧХУ приводило к выраженным изменениям в поведении. Сразу после воздействия токсического агента учащалось дыхание, при выходе из наркоза животные проявляли беспокойство и агрессию по отношению друг к другу.
На протяжении суток после разделения животных на группы различий в их поведении не было обнаружено. Все животные угнетены, малоподвижны, интенсивно пьют, шерсть приобретает желтый цвет. На вторые-третьи сутки состояние животных 2,3,4 групп расценено как более тяжелое. У них отмечались все признаки интоксикации и полиорганной недостаточности: отказ от приема воды и пищи, учащение дыхания, проявления геморрагического синдрома, взъерошенность шерстяного покрова. Животные 2 группы отличались по тяжести состояния от животных 3-4 групп, где признаки токсического воздействия были менее выражены. Животные 1 группы в те же сроки сохраняли активность, принимали пищу, лишь у двух крыс отмечалось носовое кровотечение.
4.1.2. Летальность в экспериментальных группах
Данные по летальности у крыс в экспериментальных группах представлены в табл. 4.1. Как следует из таблицы, к 6 суткам погибли 36,7% первой группы и 100% в группе 2 (p=0,0001), 93,3% в группе 3 (p=0,0001) и 86,7% в группе 4 (p=0,001).
Таблица 4.1.
Летальность в первой серии экспериментов
№ группы |
Число погибших животных в сутки |
Живы / погибли |
P |
||||
2 сут |
3 сут |
4 сут |
5 сут |
6 сут |
|||
1 (n=30) |
4 |
5 |
1 |
1 |
- |
19/11 |
|
2 (n=30) |
6 |
12 P1= 0,03 |
10 P1= 0,0001 |
2 |
- |
0/30 |
P1= 0,0001 |
3 (n=30) |
4 |
11 P1= 0,01 |
9 P1= 0,01 |
3 |
1 |
2/28 |
P1= 0,0001 |
4 (n=30) |
5 |
9 P1= 0,2 |
8 P1= 0,02 |
2 |
2 |
4/26 |
P1= 0,001 P2 = 0,06 |
Примечание: значимость различий летальности определена точным методом Фишера для четырехпольной таблицы; p1 – значимость различий летальности по сравнению с 1 группой; p2 – значимость различий летальности по сравнению со 2 группой.
Если в основной группе максимальная летальность наблюдалась на первые-вторые сутки эксперимента, то в контрольных группах этот показатель был смещен на одни сутки. На вторые сутки эксперимента летальность в основной группе была существенно (p=0,03; p= 0,01) ниже, чем в группах 2 и 3 и не имела статистически значимых различий с показателем в группе 4 (p=0,2). Но уже к четвертым суткам различия в летальности в сравниваемых группах оказались значимыми - в основной группе она была существенно ниже по сравнению со 2,3,4 группами (p=0,00001; 0,01; 0,02 соответственно). Значимость различий по анализированному показателю сохранялась и в дальнейшем - до 6 суток (срок окончания эксперимента).
Поскольку различия выживаемости в группах 1 и 4 оказались значимыми, нами сделано заключение о низкой эффективности применения ткани плаценты по сравнению с введением культуры клеток печени. Отметим в то же время, что присутствовала тенденция к значимости различий летальности животных во 2 и 4 группах. В ходе дальнейших экспериментов мы исключили контроль с введением ткани плаценты, поскольку посчитали нецелесообразным проведение дальнейшего сравнительного исследования.
В следующей серии подострых опытов нами проведено исследование некоторых показателей гомеостаза и структурных закономерностей изменения ткани печени у крыс с острым токсическим повреждением печени в условиях ксенотрансплантации культуры клеток печени (основная группа) и в двух контрольных группах (инъекция физиологического раствора и питательной среды).