- •Список сокращений
- •Оглавление
- •Глава 2. Материалы и методы исследования 29
- •Глава 3. Получение криоконсервированной культуры эмбриональных клеток свиной печени для ксенотрансплантации 41
- •Глава 4. Оценка эффективности ксенотрансплантации криоконсервированной культуры клеток эмбриональной печени в коррекции острого токсического повреждения печени 54
- •Глава 5. Структурная оценка влияния ксенотрансплантации культуры эмбриональных клеток печени 69
- •Введение
- •Применение клеток печени для коррекции острой печеночной недостаточности (обзор литературы)
- •1.1 Способы клеточной метаболической поддержки в коррекции печеночной недостаточности
- •1.2. Способы коррекции острой печеночной недостаточности в эксперименте
- •1.2.1. Моделирование острой печеночной недостаточности
- •1.2.2. Механизмы острого токсического повреждения печени при введении сСl4
- •1.2.3.Критерии эффективности метаболической клеточной коррекции опн
- •1.3. Трансплантация гепатоцитов в коррекции острой печеночной недостаточности
- •1.3.1. Способы приготовления гепатоцитов для трансплантации
- •1.3.2. Криоконсервация
- •1.3.3.Приготовление препарата для ксенотрансплантации
- •1.3.4. Способы ксенотрансплантации
- •Глава 2. Материалы и методы исследования
- •2.1 Общая характеристика экспериментального материала
- •2.2.2.1. Культура клеток печени
- •2.2.2.2. Приготовление ткани плаценты для ксенотрансплантации
- •2.2.2.3.Приготовление питательной среды для инъекции
- •2.2.3. Методы лабораторного контроля
- •2.2.3.1.Определение массы печени
- •2.2.3.2.Определение биохимических показателей сыворотки крови
- •2.2.3.3.Исследование показателей системы гемостаза
- •2.2.4.Методы морфологического исследования
- •2.3.Методы статистической обработки
- •Глава 3. Получение криоконсервированной культуры эмбриональных клеток свиной печени для ксенотрансплантации
- •3.1.Технология получения культуры клеток печени
- •3.1.1 Дезагрегация печеночной ткани
- •3.1.2. Оптимизация рН среды для культивации клеток
- •3.1.3 Очистка и культивирование эмбриональных клеток свиной печени
- •3.2.Консервация клеток
- •3.2.1. Приготовление среды для криоконсервации
- •3.2.2. Сравнительная оценка эффективности криоконсервации культуры эмбриональных клеток свиной печени
- •3.3. Получение препарата и ксенотрансплантация
- •Глава 4. Оценка эффективности ксенотрансплантации криоконсервированной культуры клеток эмбриональной печени в коррекции острого токсического повреждения печени
- •4.1.Течение острого токсического повреждения печени на фоне метаболической коррекции
- •4.1.1. Ход эксперимента
- •4.1.2. Летальность в экспериментальных группах
- •4.2. Динамика биохимических показателей при остром токсическом повреждении печени под влиянием ксенотрансплантации криоконсер-вированной культуры эмбриональных клеток печени
- •4.2.1. Уровень альбумина в сыворотке крови
- •4.2.2. Уровень холестерина
- •4.2.3. Уровень билирубина
- •4.2.4. Активность индикаторных ферментов
- •4.3. Динамические изменения некоторых показателей системы гемостаза
- •4.3.1. Уровень фибриногена в плазме крови
- •4.3.2. Вязкость крови
- •4.3.3. Гематокрит
- •4.3.4. Агрегация тромбоцитов
- •Глава 5. Структурная оценка влияния ксенотрансплантации культуры эмбриональных клеток печени
- •5.1. Морфологическое исследование зоны трансплантации
- •5.2. Макроскопическая характеристика печени животных
- •5.3. Характеристика строения печени при световой микроскопии
- •5.4. Ультраструктура гепатоцитов при остром токсическом повреждении печени, корригированном ксенотрансплантацией культуры эмбриональных клеток печени
- •5.5. Содержание днк в ядрах гепатоцитов
- •Заключение
- •Практические рекомендации
- •Список использованной литературы
2.2.2.2. Приготовление ткани плаценты для ксенотрансплантации
Источником плаценты служили остатки абортного материала, полученные в результате самопроизвольных выкидышей, при операции (малое кесарево сечение), а также при вызывании преждевременных родов по медицинским показаниям (12 недельного срока внутриутробного развития плода). Ткань получали путем гомогенезации в асептических условиях стерильного бокса. Выделенную ткань подвергали криоконсервации по методу М.С.Маргулиса на протяжении 2 месяцев.
2.2.2.3.Приготовление питательной среды для инъекции
Животным второй контрольной группы проводили инъекцию 1 мл питательной среды для культивации в составе: среда RPMI с добавлением инсулина 0,06 мкг\мл, глюкагона 1,0 Е-6, HEPES 1,0 E-2, фетуина 1мг\мл) [3, 35, 76].
Зона и техника введения препаратов контрольным животным были идентичными манипуляциям, проведенным на крысах первой группы.
2.2.3. Методы лабораторного контроля
2.2.3.1.Определение массы печени
Массу печени измеряли на лабораторных весах, со стандартным набором разновесов. Взвешивание производили при комнатной температуре тотчас после аутопсии.
2.2.3.2.Определение биохимических показателей сыворотки крови
Определение биохимических показателей сыворотки крови подопытных крыс проводили в лаборатории биохимии (зав. Шехина Н.И.) Иркутской государственной Ордена "Знак Почета" областной клинической больницы (гл.врач - Заслуженный врач Российской Федерации канд.мед. наук Птиченко Ю.Л.) на анализаторе "Синхрон-5" фирмы Beckman (США). Кровь для исследований забирали из бедренной вены подопытных крыс под эфирным наркозом. Животных фиксировали к операционному столику в положении на спине. После антисептической обработки операционного поля рассекали кожу на внутренней стороне бедра, обнажали сосуд и проводили венепункцию. Кровь центрифугировали в течение 20 минут в лабораторной центрифуге ОПН-3, с угловой скоростью 3000 об\мин. Полученную сыворотку собирали микропипеткой и замораживали при температуре –4о С.
Исследование проводили одномоментно с использованием стандартного набора реактивов фирмы Beckman.
Для определения нормальных показателей использована сыворотка крови 6 крыс без индукции острого токсического повреждения печени. Исследовали концентрацию альбумина, общего и прямого билирубина, холестерина, а также показатели активности аланинаминотрансферазы и аспартатаминотрансферазы в сыворотке крови 6-10 подопытных крыс каждой группы на 2,4 и 6 (в основной группе) сутки эксперимента.
2.2.3.3.Исследование показателей системы гемостаза
Изучение показателей системы гемостаза у экспериментальных животных выполняли в лаборатории гемостаза (зав.- канд.мед. наук Марченко В.И.) института хирургии ВСНЦ СО РАМН.
Нормальные показатели определены у 6 здоровых крыс-самцов использованной линии.
В работе использовали метод определения гематокрита с помощью микроцентифуги [6].
Агрегацию тромбоцитов определяли визуальным микрометодом агрегационной активности тромбоцитов с агрегирующими агентами [71]. Нормальный показатель (средняя величина) был принят за 100%. Агрегацию тромбоцитов у крыс экспериментальных групп выражали в процентах к норме.
Концентрацию фибриногена определяли с помощью микрометода Парорентьева [16]. Для исследования брали венозную кровь в пробирке с 3,8% цитрата натрия в соотношении 9:1. Вязкость крови на бумаге исследовали по методу А.Ф. Пирогова (1968) [66, 67]. Все показатели исследованы у 6-10 крыс всех экспериментальных групп на 2,4 и 6 (основная группа) сутки эксперимента.