1.3.4. Способы ксенотрансплантации

Трансплантация гепатоцитов под кожу - наиболее простой способ введения донорского материала, свободный от осложнений, возможных при внутриорганном введении клеток [18, 111]. Cчитают, что этот способ введения изолированных ГЦ полезен при лечении осложненных форм ОПН и хронических заболеваний печени [13, 18, 219].

В варианте "подкожного клеточного диализа" эта методика с успехом применена в клинике у наиболее тяжелой группы пациентов [10].

Разновидностью подкожного использования изолированных гепатоцитов является введение клеток под влагалище прямой мышцы живота детям в дозе 3,7х10⁶-2,5х10⁸ клеток, полученных у 9-17 -недельных плодов человека с целью восполнения врожденных нарушений обмена и иммунитета [27, 70, 72, 195].

Хотя трансплантация гепатоцитов под кожу технически проста, потенциальное пространство жировой прослойки для неоорганогенеза невелико. После трансплантации в дорзальную жировую прослойку гепатоциты быстро организуются и продолжают проявлять характерные фенотипические свойства [110, 143].

Среди различных эктопических зон для пересадки полость брюшины удовлетворяет нескольким из желаемых характеристик - возможность введения большого объема ткани, доступность применения микроносителей [88, 90, 96, 243, 259].

Несмотря на то, что выживание гепатоцитов в полости брюшины описано ранее, интраперитонеальная трансплантация свободной взвеси гепатоцитов приводит к гибели клеток [127], поэтому была разработана эффективная технология прикрепления донорских клеток к носителям [88, 90, 243, 247, 259,] c морфо-функциональным подтверждением выживания ГЦ и участия в метаболических процессах [90, 95, 96, 117, 168, 219, 247, 251, 252, 253].

Поскольку выживаемость клеток при ТГЦ требует условий, созданных в печени, взаимодействие между компонентами внеклеточного матрикса в присутствии специфических факторов роста и других типов печеночных клеток должны обеспечить пересаженным гепатоцитам оптимальные условия для выживания, дифференцировки и пролиферации [122, 148]. Гепатоциты, трансплантированные в печень попадают в синусоиды, где будут выполнять свои органоспецифические функции, так как они находятся в благоприятных условиях и контактируют с портальной кровью [46]. В эксперименте на животных с ОПН был получен положительный эффект при внутрипортальном введении гепатоцитов [12, 48, 117, 175, 219, 227, 231, 232].

Подобные результаты получены при введении ГЦ в паренхиму пораженной печени путем чрескожной пункции органа [4, 53].

Для дифференцировки пересаженных и собственных ГЦ были разработаны трансплантационные системы с использованием трансгенной технологии на животных [121, 126, 200].

Идентификация линий природных мутантных животных также обеспечивает генетические системы для изучения печеночного восстановления при клеточной трансплантации [124, 166, 202, 203].

Широкое распространение получило использование радиоактивной и флюоресцентной меток для анализа биологической востребованности пересаженных гепатоцитов [118, 119, 121, 126, 198, 200, 202, 203, 204, 226, 233, 238].

Авторами установлено, что трансплантированные гепатоциты локализуются после хирургического вмешательства в печеночных синусоидах и впоследствии мигрируют из сосудов и внедряются в печеночную паренхиму. При повторной трансплантации происходит прогрессивное увеличение репопуляции печени. [166, 194].

Интересные результаты были получены при трансплантации крысиных гепатоцитов мышам. С использованием специальной технологии стимуляции пролиферации донорских крысиных гепатоцитов в мышиной печени при помощи введения ростовых факторов, получили мышей, печень которых к концу эксперимента состояла на 90% из гепатоцитов крыс [210].

Техника доставки гепатоцитов, оптимизация переноса генов,условия безопасности являются важными этапами в проведении исследований на человеке [118, 152, 191, 192, 205]. При трансплантации гепатоцитов в селезенку достигается наилучший морфо-функциональный результат [148, 190, 191].

При этом отмечено размножение гепатоцитов в пульпе селезенки. В.Sommer и D.Suterland опубликовали данные о трансплантации живых гепатоцитов в селезенку у крыс с тяжелой интоксикацией D-галактозамином, при этом было достигнуто значительное увеличение выживаемости животных [127, 129, 231, 232, 234, 236].

Аналогичные результаты получены P. Maganto [168]. Трансплантация ГЦ в пульпу селезенки приводит к их приживлению и нормальному функционированию [94, 157, 161, 186, 220, 262].

Авторами установлено, что большая часть ГЦ трансплантированных в селезенку, перемещается в печень. Тем не менее, оставшиеся в селезенке клетки выживают, пролиферируют и функционируют. "Гепатизация" селезенки, развивающаяся после ТГЦ, встречается совершенно четко. В течении нескольких часов после трансплантации ГЦ присутствуют в виде скоплений в красной пульпе селезенки и под капсулой селезенки [82, 157].

После 2-3 месяцев трансплантированные в селезенку клетки печени становятся организованными в тяжи, розетки и псевдоацинусы [94]. В трансплантированных гепатоцитах при электронной микроскопии отмечается наличие характерных органелл, показаны гликоген, альбумин,глюкозо-6-фосфатаза и ферменты уреазного цикла [94, 132, 157, 159, 169, 190]. Метаболические исследования показали функционально активные цикл мочевины и систему цитохрома Р-450, а также секрецию альбумина [193], глюкуронизацию билирубина [262] и выведение органических анионов, таких как ^99м Тс HIDA [253, 254].

В ряде исследований была показана коррекция гипербилирубинемии у крыс Gunn с появлением глюкуронидов билирубина в желчи, когда нормальные ГЦ были пересажены в селезенку [251, 252]

Уровень синтеза ДНК в гепатоцитах, пересаженных в селезенку, выше, чем в клетках печени реципиента [120, 144, 255].

Трансплантированные ГЦ отвечают на циркулирующие факторы, такие как фактор роста гепатоцитов, которые имеют значение для увеличения массы трансплантированных гепатоцитов [148, 188]

Последние иследования показывают, что условия портального кровоснабжения ГЦ, пересаженных в селезенку, могут дать возможность начальному гепатоцеллюлярному дисморфогенезу, что облегчило бы приживание клеток и пролиферацию в ранние сроки [82, 141, 146, 223, 226, 250].

Компоненты экстрацеллюлярного матрикса или другие неопределенные факторы селезенки вносят вклад в процесс приживления [94].

Большая часть ГЦ трансплантированных внутриселезеночно, мигрирует из селезенки [126, 141, 200, 252, 253]. Анализ распределения трансплантированных ГЦ показал, что внутриселезеночно введенные клетки появляются в воротном кровотоке немедленно после трансплантации. Основная фракция гепатоцитов перемещается в печень. Трансплантированные клетки были также показаны в легких, в то время как внутрипеченочная транслокация гепатоцитов является желательной, миграция в легкие через портосистемные каналы или коллатерали может потенциально вызывать серьезные осложнения. Маркировка ¹¹¹In позволила определить локализацию трансплантированных ГЦ при сканировании всего тела и провести анализ биораспределения [119, 124, 180].

Внутриселезеночная ТГЦ чревата осложнениями, такими как инфаркт селезенки, периспленит, тромбоз воротной вены [217], транзиторная портальная гипертензия [125, 126, 245, 248, 249].

Выживаемость и проявление функциональной активности изолированных гепатоцитов, трансплантированных в различные места и органы, неоднозначны и по результативности неодинаковы.В связи с этим продолжается активный поиск рациональных способов трансплантации изолированных гепатоцитов для обеспечения их метаболической активности и сохранности. Есть сообщения о трансплантации изолированных гепатоцитов вместе с тканью поджелудочной железы [111, 183, 212, 215, 241, 254, 263].

Авторы делают вывод о гепатотропном действии клеток поджелудочной железы, которые способствуют росту и регенерации ГЦ. Выживаемость ГЦ после трансплантации в почечную капсулу ограничена, хотя может быть улучшена одновременной трансплантацией панкреатических островков, которые могут локально продуцировать улучшающие гепатотрофические факторы [212].

Хотя выживаемость трансплантированных ГЦ показана сама по себе, этот прoцесс менее изучен [141, 183, 255]. Введение гепатоцитов через внутреннюю яремную вену в легочный кровоток сопровождалось ограниченным выживанием клеток и существенной летальностью [227]. С другой стороны, выживание ГЦ в легком показано при введении прямо в легочную паренхиму [204, 222].

В последнее время в качестве зоны для ТГЦ рассматривают подслизистую оболочку тонкой кишки [150].

Применимость трансплантации ГЦ у человека ограничена реакцией отторжения, назначение цитостатиков дало ограниченный успех [94, 168, 172].

Ультрафиолетовое облучение и клеточная культивация культуры гепатоцитов способны уменшить реакцию отторжения [195, 234, 238].

Некоторые авторы предлагают пересаживать клетки донора в тимус реципиента [107, 176, 239, 245].

Некоторые исследователи сфокусировали свои исследования на создание иммунноизолированных ГЦ. Инкапсуляция клеток в избирательно непроницаемых синтетических альгинат-полилизиновых мембран обеспечивает выживание и функцию in vitro,а также in vivo [100-102, 123, 246].

Преимущества применения эмбриональной ткани печени

В последнее время внимание авторов привлекли эмбриональные клетки. Имплантированные эмбриональные клетки и их ассоциаты практически не вызывают иммунной реакции отторжения, поскольку в 1 и 2 триместрах гестации еще не экспрессированы белки гистосовместимости 1 и 2 класса [34, 59, 69].

Изолированные ГЦ фетальной печени не только не развивают сами интенсивной реакции «трансплантат против хозяина» при пересадке в иммунологически ослабленный организм, но и тормозят такую реакцию со стороны полноценных иммунокомпетентных клеток [195].

Интраперитонеальная трансплантация человеческих эмбриональных ГЦ обеспечила восстановление у 3 из 7 пациентов с ОПН, хотя выживаемости пересаженных клеток не было показано [131]. Поскольку ГЦ зародыша демонстрируют некоторые дифференцированные функции, включая синтез альбумина, продукцию желчи и активность энзимов мочевинного цикла [80], можно предположить, что их пересадка обеспечит более эффективную метаболическую поддержку. Остается неясным, связано ли улучшение результатов непосредственно с выживанием и функцией трансплантированных ГЦ, или потому, что введены аллогенные или ксеногенные клетки, клеточные фрагменты, биологически активные вещества [102, 170-172].

К тому же было показано, что летальность при ОПН может быть уменьшена введением среды от первичной культуры гепатоцитов [81].

В настоящее время разработана эффективная технология выделения и криоконсервации эмбриональных клеток печени [77, 154]..

Сказанное делает необходимым исследование эффективности ТГЦ с использованием эмбриональной ткани для коррекции ОПН. Этой проблеме и посвящено настоящее исследование.