- •Список сокращений
- •Оглавление
- •Глава 2. Материалы и методы исследования 29
- •Глава 3. Получение криоконсервированной культуры эмбриональных клеток свиной печени для ксенотрансплантации 41
- •Глава 4. Оценка эффективности ксенотрансплантации криоконсервированной культуры клеток эмбриональной печени в коррекции острого токсического повреждения печени 54
- •Глава 5. Структурная оценка влияния ксенотрансплантации культуры эмбриональных клеток печени 69
- •Введение
- •Применение клеток печени для коррекции острой печеночной недостаточности (обзор литературы)
- •1.1 Способы клеточной метаболической поддержки в коррекции печеночной недостаточности
- •1.2. Способы коррекции острой печеночной недостаточности в эксперименте
- •1.2.1. Моделирование острой печеночной недостаточности
- •1.2.2. Механизмы острого токсического повреждения печени при введении сСl4
- •1.2.3.Критерии эффективности метаболической клеточной коррекции опн
- •1.3. Трансплантация гепатоцитов в коррекции острой печеночной недостаточности
- •1.3.1. Способы приготовления гепатоцитов для трансплантации
- •1.3.2. Криоконсервация
- •1.3.3.Приготовление препарата для ксенотрансплантации
- •1.3.4. Способы ксенотрансплантации
- •Глава 2. Материалы и методы исследования
- •2.1 Общая характеристика экспериментального материала
- •2.2.2.1. Культура клеток печени
- •2.2.2.2. Приготовление ткани плаценты для ксенотрансплантации
- •2.2.2.3.Приготовление питательной среды для инъекции
- •2.2.3. Методы лабораторного контроля
- •2.2.3.1.Определение массы печени
- •2.2.3.2.Определение биохимических показателей сыворотки крови
- •2.2.3.3.Исследование показателей системы гемостаза
- •2.2.4.Методы морфологического исследования
- •2.3.Методы статистической обработки
- •Глава 3. Получение криоконсервированной культуры эмбриональных клеток свиной печени для ксенотрансплантации
- •3.1.Технология получения культуры клеток печени
- •3.1.1 Дезагрегация печеночной ткани
- •3.1.2. Оптимизация рН среды для культивации клеток
- •3.1.3 Очистка и культивирование эмбриональных клеток свиной печени
- •3.2.Консервация клеток
- •3.2.1. Приготовление среды для криоконсервации
- •3.2.2. Сравнительная оценка эффективности криоконсервации культуры эмбриональных клеток свиной печени
- •3.3. Получение препарата и ксенотрансплантация
- •Глава 4. Оценка эффективности ксенотрансплантации криоконсервированной культуры клеток эмбриональной печени в коррекции острого токсического повреждения печени
- •4.1.Течение острого токсического повреждения печени на фоне метаболической коррекции
- •4.1.1. Ход эксперимента
- •4.1.2. Летальность в экспериментальных группах
- •4.2. Динамика биохимических показателей при остром токсическом повреждении печени под влиянием ксенотрансплантации криоконсер-вированной культуры эмбриональных клеток печени
- •4.2.1. Уровень альбумина в сыворотке крови
- •4.2.2. Уровень холестерина
- •4.2.3. Уровень билирубина
- •4.2.4. Активность индикаторных ферментов
- •4.3. Динамические изменения некоторых показателей системы гемостаза
- •4.3.1. Уровень фибриногена в плазме крови
- •4.3.2. Вязкость крови
- •4.3.3. Гематокрит
- •4.3.4. Агрегация тромбоцитов
- •Глава 5. Структурная оценка влияния ксенотрансплантации культуры эмбриональных клеток печени
- •5.1. Морфологическое исследование зоны трансплантации
- •5.2. Макроскопическая характеристика печени животных
- •5.3. Характеристика строения печени при световой микроскопии
- •5.4. Ультраструктура гепатоцитов при остром токсическом повреждении печени, корригированном ксенотрансплантацией культуры эмбриональных клеток печени
- •5.5. Содержание днк в ядрах гепатоцитов
- •Заключение
- •Практические рекомендации
- •Список использованной литературы
2.2.4.Методы морфологического исследования
Обзорная световая микроскопия, контроль жизнеспособности клеток для трансплантации и электронная микроскопия были выполнены в лаборатории патоморфологии (зав.- ст. н.с. Гольдберг О.А.). Обзорная световая микроскопия и цитологические исследования выполнены совместно с О.А. Гольдбергом.
Для обзорной световой микроскопии материал фиксировали в 10% нейтральном растворе формалина. На светооптическом уровне исследовали парафиновые срезы, окрашенные гематоксилином и эозином, суданом - III на липиды. Препараты исследовали в Фотомикроскопе III [1, 2] .
Для определения клеточного состава ткани печени крыс на 2 и 4 сутки эксперимента проводили морфометрию с использованием окуляр - микрометра. С помощью окулярной морфометрической сетки подсчитывали количество гепатоцитов с сохранной структурой, количество гепатоцитов с наличием крупных вакуолей в цитоплазме, непаренхиматозные фагоцитирующие клеточные элементы в 5 полях зрения (площадь каждого поля зрения составляла 25600 мкм2) на препаратах печени 6 крыс каждой группы. Препараты исследовали с использованием иммерсионного объектива при конечном увеличении х1200.
Для электронной микроскопии фрагменты печени, забранные на 2,4,и 6 (основная группа) сутки эксперимента помещали в 10% раствор параформальдегида на 0,1М фосфатном буфере (рН 7,4) и фиксировали в течение 24 часов. После промывки постфиксировали в 1% растворе OsO4 на том же буфере с 0,1М сахарозой в течение 2-х часов, дегидратировали в спиртах восходящей концентрации и заливали в эпон-аралдит.
Ультратонкие срезы толщиной 300-400 Ао нарезали на ультратоме LKB-Nova (Швеция), монтировали на сетки, покрытые формваром. После окрашивания насыщенным водным раствором уранилацетата и цитратом свинца просматривали в электронном микроскопе EM 400 D (Phillips, Голландия) при ускоряющем напряжении 80 КВ. На ультратонких срезах, полученных с каждого блока, фотографировали по 2 случайно выбранных участка цитоплазмы гепатоцитов так, чтобы на одно наблюдение приходилось 8-10 фотопластинок, при увеличении х24000.
Морфометрический анализ ультраструктурной организации паренхиматозных клеток печени проводили на фотографиях при конечном увеличении х45000 с помощью открытой тестовой системы по формуле V=(Pt\Pk)х100,
где Рt-число узлов тестовой решетки, попавшей на митохондрии или мембраны гранулярного эндоплазматического ретикулума; Pk- число узлов тестовой решетки. Всего было исследовано 80 фотографий.
Патоморфологический раздел работы проведен совместно со старшими научными сотрудниками О.А.Гольдбергом и Ю.В. Гладышевым.
Количественная цитофотометрия была проведена совместно с Ю.В.Гладышевым в лаборатории иммуноморфологии Института физиологии СО РАМН (зав. лабораторией - академик РАМН В.А.Труфакин), г.Новосибирск.
Для исследования содержания количества ДНК в ядрах паренхиматозных клеток печени парафиновые срезы толщиной 5 мкм нарезали на микротоме LKB (Швеция), монтировали на стекла, окрашивали реактивом Шиффа после предварительного гидролиза в 1 N соляной кислоте по методу Томази. Реактив Шиффа готовили по стандартной методике [52].
После обработки сернистыми водами, спиртами и ксилолом срезы заключали в бальзам. Количественную цитофотометрию проводили на автоматическом анализаторе "Протва" методом сканирования. Измерения проводили при освещении монохроматическим светом с длиной волны 550 нм, увеличение объектива х90, при шаге сканирования 0,01 мкм и диаметре зонда 0,1 мкм в Институте физиологии СО РАМН г.Новосибирска. В каждой группе количество ДНК было измерено в 100-120 ядрах. В качестве диплоидного стандарта использовали ядра малых лимфоцитов селезенки от интактных животных. Результаты измерений выражали в единицах плоидности, принимая за диплоидный набор количество ДНК в ядрах лимфоцитов. Кроме содержания ДНК анализатор вычислял и площадь ядер клеток. Во всех случаях исследовали только одноядерные гепатоциты.
Морфометрические исследования образцов печени выполняли общепринятыми методами стереологических исследований в соответствии с общепринятыми нормами и рекомендациями [1, 2, 31, 61, 256, 257].