- •Список сокращений
- •Оглавление
- •Глава 2. Материалы и методы исследования 29
- •Глава 3. Получение криоконсервированной культуры эмбриональных клеток свиной печени для ксенотрансплантации 41
- •Глава 4. Оценка эффективности ксенотрансплантации криоконсервированной культуры клеток эмбриональной печени в коррекции острого токсического повреждения печени 54
- •Глава 5. Структурная оценка влияния ксенотрансплантации культуры эмбриональных клеток печени 69
- •Введение
- •Применение клеток печени для коррекции острой печеночной недостаточности (обзор литературы)
- •1.1 Способы клеточной метаболической поддержки в коррекции печеночной недостаточности
- •1.2. Способы коррекции острой печеночной недостаточности в эксперименте
- •1.2.1. Моделирование острой печеночной недостаточности
- •1.2.2. Механизмы острого токсического повреждения печени при введении сСl4
- •1.2.3.Критерии эффективности метаболической клеточной коррекции опн
- •1.3. Трансплантация гепатоцитов в коррекции острой печеночной недостаточности
- •1.3.1. Способы приготовления гепатоцитов для трансплантации
- •1.3.2. Криоконсервация
- •1.3.3.Приготовление препарата для ксенотрансплантации
- •1.3.4. Способы ксенотрансплантации
- •Глава 2. Материалы и методы исследования
- •2.1 Общая характеристика экспериментального материала
- •2.2.2.1. Культура клеток печени
- •2.2.2.2. Приготовление ткани плаценты для ксенотрансплантации
- •2.2.2.3.Приготовление питательной среды для инъекции
- •2.2.3. Методы лабораторного контроля
- •2.2.3.1.Определение массы печени
- •2.2.3.2.Определение биохимических показателей сыворотки крови
- •2.2.3.3.Исследование показателей системы гемостаза
- •2.2.4.Методы морфологического исследования
- •2.3.Методы статистической обработки
- •Глава 3. Получение криоконсервированной культуры эмбриональных клеток свиной печени для ксенотрансплантации
- •3.1.Технология получения культуры клеток печени
- •3.1.1 Дезагрегация печеночной ткани
- •3.1.2. Оптимизация рН среды для культивации клеток
- •3.1.3 Очистка и культивирование эмбриональных клеток свиной печени
- •3.2.Консервация клеток
- •3.2.1. Приготовление среды для криоконсервации
- •3.2.2. Сравнительная оценка эффективности криоконсервации культуры эмбриональных клеток свиной печени
- •3.3. Получение препарата и ксенотрансплантация
- •Глава 4. Оценка эффективности ксенотрансплантации криоконсервированной культуры клеток эмбриональной печени в коррекции острого токсического повреждения печени
- •4.1.Течение острого токсического повреждения печени на фоне метаболической коррекции
- •4.1.1. Ход эксперимента
- •4.1.2. Летальность в экспериментальных группах
- •4.2. Динамика биохимических показателей при остром токсическом повреждении печени под влиянием ксенотрансплантации криоконсер-вированной культуры эмбриональных клеток печени
- •4.2.1. Уровень альбумина в сыворотке крови
- •4.2.2. Уровень холестерина
- •4.2.3. Уровень билирубина
- •4.2.4. Активность индикаторных ферментов
- •4.3. Динамические изменения некоторых показателей системы гемостаза
- •4.3.1. Уровень фибриногена в плазме крови
- •4.3.2. Вязкость крови
- •4.3.3. Гематокрит
- •4.3.4. Агрегация тромбоцитов
- •Глава 5. Структурная оценка влияния ксенотрансплантации культуры эмбриональных клеток печени
- •5.1. Морфологическое исследование зоны трансплантации
- •5.2. Макроскопическая характеристика печени животных
- •5.3. Характеристика строения печени при световой микроскопии
- •5.4. Ультраструктура гепатоцитов при остром токсическом повреждении печени, корригированном ксенотрансплантацией культуры эмбриональных клеток печени
- •5.5. Содержание днк в ядрах гепатоцитов
- •Заключение
- •Практические рекомендации
- •Список использованной литературы
3.1.2. Оптимизация рН среды для культивации клеток
Известно, что рН ткани печени составляет в норме 7,4. В процессе работы мы обратили внимание на изменение рН рабочих растворов после погружения в них взвеси выделенных клеток с 7,2 (рН стандартных питательных сред RPMI, 199, Хенкса) до 6,9, что было связано со снижением выхода жизнеспособных клеток (табл. 3.2).
Таблица 3.2
Жизнеспособность клеток печени в процессе диссоциации и рН рабочих растворов
Жизнеспособность клеток после выделения (%) |
n |
pН среды исходн., M ± m |
pН среды конечн., M ± m |
P |
r |
40-69 |
39 |
7,3 ± 0,3 |
6,8 ± 0,3 |
p< 0,05 |
+ 0,71 p< 0,05 |
70-85 |
82 |
7,4 ± 0,02 |
7,2 ± 0,2 |
p< 0,05 |
|
86-99 |
109 |
7,6 ± 0,01 |
7,4±0,01 |
- |
Примечание: значимость различий определена по сравнению с интервалом 86-99% .
Как следует из табл. 3.2, при ранжировании результатов выделения клеточной взвеси по ее жизнеспособности на 3 группы (40-69% - низкий результат по литературным данным; 70-85% - наиболее частый показатель жизнеспособности; 86-99% - высокий показатель), отмечены существенные различия в рН питательной среды. Таким образом, закисление среды находилось в причинно-следственной связи с витальными характеристиками культивируемого материала (r= + 0,71; p<0,05).
Для определения уровня закисления питательной среды при размещении в ней взвеси клеток мы провели серию экспериментов с вариацией исходного рН среды при размещении культуры клеток с заданной жизнеспособностью (табл. 3.3).
Таблица 3.3
Изменение рН питательной среды при размещении в ней взвеси выделенных клеток печени
Исходная рН питательной среды |
рН после размещения клеточной взвеси |
|
n |
M ± m |
|
7,2 * |
56 |
6,9 ± 0,02 ** |
7,4 |
51 |
7,1 ± 0,03 ** |
7,6 |
108 |
7,4 ± 0,01 |
7,8 |
15 |
7,6 ± 0,02 ** |
Примечание: показатель жизнеспосбности и объем внесенных клеток был одинаковым во всех сериях наблюдений; * - рН стандартной питательной среды RPMI, 199 и Хенкса; ** - значимость различий опеределена по сравнению с pH=7,6 - pU<0,00001.
Оказалось, что снижение рН при исходных значениях в среде 7,6-7,8 составило 0,2, а при показателях pH=7,2-7,4 закисление было более выраженным (0,3), что ухудшало результаты, согласно данным табл. 3.2.
В следующей серии опытов мы измеряли жизнеспособность клеток после кратковременной инкубации в питательной среде с заданной рН, которую определяли после введения взвеси донорского материала (табл. 3.4).
Таблица 3.4
Жизнеспособность клеток, инкубированных в термостате при 370С в течение 1 часа при заданных рН
рН питательной среды после добавления клеточной взвеси |
Жизнеспособность клеток (%) M ± m |
6,9 (n=15) |
64,2±1,2* |
7,2 (n=15) |
79,3±1,0* |
7,4 (n=15) |
92,6±1,0 |
7,6 (n=15) |
76,2±12* |
Примечание: значимость различий определена по сравнению с рН 7,4; * - pU< 0,00001
Максимальной жизнеспособности клеток удалось добиться при инкубировании в среде с рН 7,4. Следовательно, исходный показатель рН среды для культивации, с учетом закономерного закисления среды (0,2 – см. табл. 3.3), должен составлять 7,6.