2.3.Методы статистической обработки
Определение значимости различий полученных данных (р) проводили после проверки нормальности распределения результатов в сравниваемых группах [37].
Применяли тесты Колмогорова-Смирнова и Шапиро-Вилкса. Для малых выборок (менее 30) и в случае ненормального распределения результатов значимость различий определяли по критерию Манна-Уитни (U); при этом количественные данные представляли в тексте диссертации в средних величинах с указанием числа наблюдений и 95% доверительного интервала. Достоверность различий в летальности животных основной и контрольных групп в первой серии эксперимента определена с помощью точного метода Фишера для четырехпольной таблицы.
Значимость различий в жизнеспособности клеточных культур, численных данных биохимических показателей и оценки системы гемостаза, а также результатов морфометрии, определена по критерию Манна-Уитни (U) [37].
При статистическом анализе исследования ультраструктуры значимость различий определяли с применением критерия Стьюдента. Для проверки гипотезы нормальности распределения исследуемых признаков использовали коэффициенты асимметрии и эксцесса. В сравниваемых группах исследовали равенство генеральных дисперсий. Данные представлены в среднем значении с 95% доверительным интервалом.
Статистическая обработка результатов проведена с помощью пакета программ Statistica for Windows 5.1 [15].
Глава 3. Получение криоконсервированной культуры эмбриональных клеток свиной печени для ксенотрансплантации
Мы не встретили при анализе мировой литературы работ, полностью освещающих технологию выделения и криоконсервации клеток эмбриональной печени. С другой стороны, существует несколько широко известных методов получения, культивации и сохранения зрелых ГЦ. Таким образом, для реализации поставленной задачи оказалось необходимым разработать в деталях процесс получения криоконсервированной культуры ЭКП свиньи для ксенотрансплантации на основе известных методик.
Основными критериями эффективности выделения, культивации и криоконсервации клеток печени являются удельный вес жизнеспособных клеток и абсолютное количество материала, получаемое из единицы массы донорской печени. Пользуясь названными критериями, мы модифицировали этот процесс.
3.1.Технология получения культуры клеток печени
3.1.1 Дезагрегация печеночной ткани
Первоначально за основу нами была взята методика двухэтапной ферментативной обработки печени in situ по M. Berry et al. (1969). В процессе работы мы столкнулись с плохой воспроизводимостью результата и получили взвесь изолированных гепатоцитов с низкой степенью жизнеспособности, которые на вторые сутки культивации погибали полностью. Поскольку эта классическая методика была разработана для получения зрелых гепатоцитов, мы применили способ выделения (с дальнейшей криоконсервацией) эмбриональных гемопоэтических клеток, предложенный профессором С.С. Лавриком (1990).
Для приготовления клеточной суспензии по С.С. Лаврику ткань эмбриональной печени мы размельчали в гомогенезаторе Поттера. Полученная взвесь содержала по данным цитологического исследования (мазки-отпечатки) гемопоэтические клетки, гепатоциты, синусоидальные клетки и клеточный детрит. Фрагменты состояли из 50-100 клеток и более. Оказалось, что полученную взвесь очень трудно стандартизировать по составу и фракционировать в силу больших размеров клеточных конгломератов. Кроме того, при контроле жизнеспособности отмечали гибель изолированных клеток при сохранности клеток, расположенных во фрагментах.
В этой связи мы отказались в дальнейшем от выделения клеток по С.С. Лаврику и положили в основу нашей методики известные приемы выделения зрелых печеночных клеток (G. Starke, P.Фрешни, Р. Адамса, М.С. Маргулиса) посредством смешанной диссоциации с применением коллагеназы на начальном этапе. При этом раствор фермента названные авторы вводят интрапаренхиматозно путем многократных пункций печеночной паренхимы.
Мы усовершенствовали метод введения коллагеназы в печень: с этой целью после лапаротомии выводили в рану печень эмбриона, пунктировали печеночную артерию, затем пережимали сосуды печени и вводили внутриартериально 4-10 мл раствора коллагеназы (5-25 мг; 2,5 мг/1 г массы печени) с экспозицией 5 мин. Затем иссеченный орган помещали в питательную среду. Перед механической диссоциацией ткани при необходимости дополнительно инфильтрировали орган раствором коллагеназы (2,5 мг/1 г массы печени). Поскольку дезагрегация с применением магнитной мешалки (Berry M.C. et al., 1969; Ricordi C. et al., 1989) ведет к потере клеток и получению изолированных гепатоцитов с низкой степенью жизнеспособности, мы применили механическое измельчение ткани печени под контролем зрения с дальнейшим продавливанием макрофрагментов обработанной ткани через иглу для внутримышечной инъекции.
Добивались выделения не изолированных ГЦ, а жизнеспособных микрофрагментов (не более 10 клеток в ассоциации) эмбриональной печени свиньи. Это объясняется трудностями культивации более крупных фрагментов (некроз центральной зоны), что известно из литературы, а также удобством подсчета клеток в камере Фукса-Розенталя, использованной нами в работе.
Для оценки эффективности выбранного метода диссоциации ткани печени, отдельные компоненты которого были известной ранее, мы исследовали жизнеспособность выделяемых клеток на всех этапах забора донорского материала, в сравнении с результатами реферированных методик (табл. 3.1).
Таблица 3.1
Сравнительная эффективность способов выделения
клеток эмбриональной печени
Способ выделения клеток |
Жизнеспособность клеток (%) M ± m; n=15 |
Кол-во клеток, полученных из 1 г ткани печени (х108) M ± m; n=7 |
Berry M.N. (1969) |
40,5±0,9* |
6,9±0,2* |
Лаврик С.С. (1990) |
64,5±1,7* |
** |
Разработанный |
91,7±1,1 |
10,3±0,2 |
Примечание: * - p<0,00001 - значимость различий по сравнению с результатами применения оригинальной методики; ** - подсчет абсолютного количества клеток затруднен в связи с большими размерами фрагментов печеночной ткани.
При гистологическом исследовании материала, полученного по модифицированной нами методике, сразу после выделения, до очистки клеточной суспензии с применением прерывистого градиента фиколла, состав клеточной суспензии был представлен эмбриональными гепатоцитами полигональной формы которые располагались большей частью группами по 2-4 клетки, макрофагами и клеточным детритом (рис. 3.1). Ядра гепатоцитов сферической формы, располагаются они, как правило, в центре цитоплазмы. Гетерохроматин и ядрышки просматриваются плохо. Цитоплазма гомогено-темная, без каких-либо включений.
Рис. 3.1. Клетки эмбриональной печени свиньи, полученные по усовершенствованной методике, до очистки в градиенте фиколла. 1 – гепатоцит; 2 – макрофаг; 3 – фрагменты поврежденных клеток
Следующим, принципиально важным этапом явился подбор рациональных условий для культивации донорского материала.