тягом 2-4 год. Потім видаляють середовище та до кожної лунки додають по 100 мкл екстракційного буферу рН 4.7. Для екстрації планшети інкубують протягом ночі при температурі 37 °С. По завершенні екстрації та повного розчинення, планшети досліджують візуально або передивляються при довжині хвилі 570 нм.

Синьо/чорна лунка враховується як негативна (всі клітини живі, токсин нейтралізований антитоксином), біла або безбарвна лунки вказують на наявність мертвих клітин (немає нейтралізації токсину), та враховуються як позитивні.

Активність випробуваного антитоксину отримують порівнюючи останню лунку стандартного препарату антитоксину, що показала повну нейтралізацію токсину, з останньою лункою препарату антитоксину, що виявив такий самий ефект. Титр нейтралізуючих антитіл випробовуваного зразка може бути розрахований шляхом множення розведення загальної кількістю МО на мілілітр стандартного препарату в кінцевій точці. Випробування вважається придатним, якщо всі клітини в контролі токсину мертві та стандартний антитоксин нейтралізує принаймні перші два досліджуваних розведення.

2.7.7.КІЛЬКІСНЕ ВИЗНАЧЕННЯ ВАКЦИНИ ДЛЯ ПРОФІЛАКТИКИ КАШЛЮКУ (ЦІЛЬНОЮПТИННОЇ)

Активність вакцини для профілактики кашляку визначають шляхом порівняння дози вакцини, необхідної для захисту мишей від ефектів летальної дози Bordetella pertussis, що вводиться інтрацеребрально,

зкількістю стандартного препарату, каліброваного

вМіжнародних одиницях (МО), яке необхідне для отримання такого ж захисту.

МО — активність, що міститься у зазначеній кількості міжнародного стандарту, що складається з певної кількості висушеної вакцини для профілактики кашлюку. Еквівалент МО міжнародного стандартного препарату встановлює Всесвітня Організація Охорони Здоров'я.

Вибір та розподіл випробовуваних тварин. У випробуванні використовують здорових мишей відповідної лінії з однієї партії, віком менше 5 тижнів. Різниця в масі між самою важкою та самою легкою твариною не має перевищувати 5 г. Мишей ділять на шість груп не менше ніж 16 в кожній та чотири групи по 10 тварин. Миші мають бути однієї статі, або самці та самки мають бути рівномірно розподілені за групами.

Вибір провокаційного штаму, та приготування суспензії для провокації. Вибирають відповідний штамм В. pertussis, здатний призвести до загибелі мишей протягом 14 діб після інтрацеребральної ін'єкції. Штамм вважають невідповідним якшо більше за

І38ДЕРЖАВНА ФАРМАКОПЕЯ УКРАЇНИ і .4

20 % мишей гине протягом 48 год після ін'єкції. Проводять одине пересівання штаму, суспензують зібрані клітини В. pertussis в розчині, що містить 10 г/л

казеїна гідролізату />та 6 г/л натрію х.юриду Р (рН від 7.0 до 7.2), або в іншому підхожому розчині. Визначають ступінь каламутності суспензії. Використовуючи вказаний розчин, готують ряд розведень. Кожне з отриманих розведень закріпляють за однією групою з не менше як із 10 мишей. Кожній миші інтрацеребрально вводять дозу (0.02 мл або 0.03 мл) розведення, що відповідає даній групі. Через 14 діб підраховують кількість мишей, що вижили в кожній з груп. Виходячи з цих результатів, обчислюють очікуваний ступінь каламутності суспензії, що містить 100 LDjoB кожній провокаційній дозі. Для визначення активності випробовуваної вакцини проводять нове пересівання того самого штаму В. pertussis, із зібраної мікробної маси готують суспензію зі ступенем каламутності, що відповідає близько 100 LD^ в кожній провокаційній дозі. Готують три розведення суспензії для провокації.

Визначення активності. Готують три послідовні розведення випробовуваної вакцини та три аналогічні розведення стандартного препарату таким чином, щоб для кожного з проміжного розведення очікуваний ступінь захисту мишей від летальних ефектів провокаційної дози В. pertussis становив 50 %. Дози, що пропонуються до випробування становлять 1/8,1/40 та 1/200 дози для людини випробовуваної вакцини та 0.5 МО, 0.1 МО та 0.02 МО стандартного препарату. Кожна з доз має міститься в об'ємі, що не перевищує 0.5 мл. За кожною з 6 груп (з не менше як 16 мишей в кожній) закріпляють одне розведення з отриманих шести. Кожній миші внугрішньоочеревно вводять одну дозу розведення, що відповідає даній групі. Через 14-17 діб кожній миші в усіх групах (не менше 16) інтрацеребрально вводять одну дозу суспензії для провокації. Використовуючи вказану суспензію готують три її розведення. Суспензію для провокацій та кожне з отриманих розведень закріплюють за однією групою з не менше як із 10 мишей кожна. Кожній миші інтрацеребрально вводять одну дозу суспензії, що відповідає даній групі. Мишей, які загибли протягом 48 год після провокації, в розрахунках не враховують. Через 14 діб підраховують кількість мишей, що вижили в кожній із груп. .Активність випробовуваної вакцини розраховують відносно активності стандартного препарату, виходячи з кількості тварин, що вижили в кожній з 6 груп (не менше ніж з 16 мишей).

Випробування вважається вірогідним, якщо:

—як для випробовуваної вакцини, так і для стандартного препарату, 50 % захисної дози знаходяться в інтервалі між найбільшою та найменшою дозами, що були введені мишам;

—кількість загиблих тварин в 4 групах по 10 мишей, яким була введена суспензія для провокації та її розведення, вказує на те, що провокаційна доза приблизно відповідач 100 tD w ;

135

— при статистичному аналізі не виявляються відхилення від лінійності та паралельності.

Випробування можна повторити, але при проведенні більше за 1 випробування результати всіх випробувань при розрахунку активності мають бути враховані.

2.7.8. КІЛЬКІСНЕ ВИЗНАЧЕННЯ ВАКЦИНИ ДЛЯ ПРОФІЛАКТИКИ ПРАВЦЯ (АДСОРБОВАНОЇ)

Активність вакцини для профілактики правцювизначають введенням вакцини тваринам (мурчакам та мишам) після їх контрольного (провокаційного) зараження правцевим токсином (метод А або В) або визначенням титру антитіл до правцевого анатоксину в сироватці мурчаків (метод С). У всіх випадках активність вакцини розраховують відносно стандартного препарату, каліброваного в Міжнародних одиницях (МО). Для методів А та В. в країнах, де метод параличу не є обов'язковим, може використовуватись метод LDS0. Для методу LD50 кількість тварин та методики ідентичні тим. що описані для методу паралічу, але за кінцеву точку приймають замість паралічу загибель тварин.

МО — активність, шо міститься у зазначеній кількості міжнародного стандарту, що складається з певної кількості правцевого анатоксину (адсорбованого). Еквівалент М О міжнародного стандартного препарату встановлює Всесвітня Організація Охорони Здоров'я.

БСП вакцини для профілактики правцю (адсорбованої') калібрований в МО по відношенню до міжнародного стандарту.

Підбір методу визначення вакцини для профілактики правцю (адсорбованої) залежить від призначення. Метод А або В використовують:

1.при розробці вакцин для кількісного визначення виготовлених партій для валідації виробництва;

2.якшо необхідно провести повторну валідацію, через значні зміни виробничих процесів.

Метод А або В можуть також використовуватися для рутинного кількісного визначення партій вакцин, але з метою збереження тварин, по можливості слід застосовуватися метод С.

компонентів може вважатися дійсною для комбінації з меншою кількістю компонентіР. та для мож>- вадентних вакцин. Будь-які комбінації, шо містять такий компонент як цільноклітинний кашлюк або вакцину для профілактики інфекцій викликаних Hemophilus influenzae типу b (кон'югована) з правцевим анатоксином в одному флаконі, мають оцінюватися окремо.

Для комбінацій, що містять дифтерійний та правцевий компоненти, серологічний аналіз (метод С) може проводитись на тій же групі тварин, досліджених при серологічному аналізі вакцини для профілактики правця (адсорбованої) (2.7.8). якщо підтверджено, що звичайні умови імунізації для компонентів дифтерії та правця (наприклад, дози, тривалість) вірогідні для комбінованих вакцин.

При розробці кількісних визначень, наведенихнижче. використовують численні розведення випробовуваного та стандартного препарату. Коли аналітик має достатній досвід роботи з методом для даної вакцини, можливе застосування спрощеної моделі, такої як одне розведення випробовуваного та стандартного препарату. Така модель дозволяє аналітику встановити, чи є активність випробовуваного препарату значно вище мінімально необхідної, але не дає інформації з лінійності, паралельності та криву доза-відповіді. Спрощена модель дозволяє значно зменшити кількість необхідних тварин, що відповідає положенню Європейської Конвенції про захист хребетних тварин, що використовуються в експериментальних та інших наукових цілях.

Якщо при кількісному визначенні використовують одне розведення, час від часу слід перевіряти відтворюваність виробництва та випробування відповідними індикаторами і періодично, наприклад, кожні 2 роки, проводити повний аналіз із численними розведеннями. Для серологічного аналізу відповідними індикаторами для контролю відтворюваності випробування є:

—середнє та стандартне відхилення відносних титрів анатоксину або число зразків сироватки, отриманих після застосування фіксованих доз стандартного препарату вакцини;

—титр антитоксину або число контрольних прогонів (позитивні та негативні зразки сироватки);

—співвідношення титрів антитоксину або числа позитивних контрольних сироваток на зразки сироваток, відповідних стандартній вакцині.

ляють не менше як на 6 рівних груп; використовують групи, шо містять достатню кількість тварин для отримання результатів, що задовольняють вимогам по вірогідному аналізу, що наведені нижче. Якщо для провокаційного токсину активність не встановлена включають ще 3 групи з 5 мурчаків, як не вакцинований контроль,

ВИБІР ПРОВОКАЦІЙНОГО ТОКСИНУ

Вибирають препарат правцевого токсину, що містить не менше 50-кратної 50 % паралітичної дози в мілілітрі. Якщо для препарату провокаційного токсину продемонстрована стабільність, перевірка паралітичної дози при кожному визначенні не потрібна.

ПРИГОТУВАННЯ РОЗЧИНУ ПРОВОКАЦІЙНОГО ТОКСИНУ

Безпосередньо перед застосуванням провокаційний токсин розводять відповідним розчинником (наприклад, буферним розчином з натрію хлоридом та пептоном рН 7.4) для отримання стабільного розчину токсину, що містить близько 50-кратної 50 % паралітичної дози в мілілітрі. Якщо необхідно для визначення активності токсину використовують порції провоьсаційного токсину розведені в тому самому розчиннику 1:16, 1:50 та 1:160).

РОЗВЕДЕННЯ ВИПРОБОВУВАНОГО ТА СТАНДАРТНОГО ПРЕПАРАТІВ

Використовуючи розчин 9 г/л натрію хлориду Р готують розведення випробовуваної вакцини та стандартного препарату, таким чином, щоб для кожного отримати серії розведень, відмінні кроком не більше за 2.5 рази, і в яких проміжні розведення при підшкірній ін'єкції становлять по 1.0 мл на мурчака, захищали б близько 50 % тварин від паралітичних ефектів після підшкірного введення кількості правцевого токсину, передбаченого для цього випробування.

ІМУНІЗАЦІЯ ТА ПРОВОКАЦІЯ

активність та стабільність для провокаційного токсину визначені при виконанні необхідної кількості визначень із 50 % паралітичною дозою, тоді в перевірці при кожному визначенні не має потреби.

ОБЛІК ТА ІНТЕРПРЕТАЦІЯ РЕЗУЛЬТАТІВ

Обстежують мурчаків кожної доби двічі на день. Вилучають та піддають евтаназії всіх тварин у яких спостерігались ознаки правцевого паралічу. Враховують кількість мурчаків протягом 5 діб без ознак паралічу після введення провокаційного токсину. Розраховують активність випробовуваної вакцини відносно активності стандартного препарату на основі співвідношення тварин з провокацією без ознак паралічу в кожній з груп вакцинованих мурчаків, використовуючи звичайний метод статистичного аналізу (наприклад, 5.3).

ВИМОГИ ДО ПРИДА ТНОСТІ ВИЗНА ЧЕННЯ

Випробування вважається вірогідним, якщо: —для випробовуваної вакцини та стандартного пре-

парату 50 % захисна доза знаходиться в інтервалі між найбільшою та найменшою дозами, що були введені мурчакам;

—де застосовне, що у випадку проведення відповідного випробування кількість паралізованих тварин в 3-х групах, по 5 мурчаків, яким ін'єкційно був введений розчин провокаційного токсину та його розведення, вказує на те, що провокація відбулася близько 50 -кратної 50 % паралітичної дози;

—довірчі інтервали (Р= 0.95) складають не менше 50 % і не більше 200 % від установленої активності;

— статистичний аналіз не виявляє значних відхилень від лінійності, паралельності та кривої дозавідповідь (стаття 5.J описує можливі альтернативи при виявленні значних відхилень).

Випробування можна повторити, але при проведенні більше за 1 випробування результати всіх випробувань при розрахунку активності мають бути враховані.

кіть вимогам вірогідного аналізу. наведених нижче. Якщо випробовуваний провокаційний токсин не стабільний або він недостатньо стандартизований, у випробу вання включають ще 3 групи з 5 мишей в кожній як невакцинований контроль.

ВИБІР ПРОВОКАЦІЙНОГО ТОКСИНУ

Вибирають препарат правцевого токсину, що містить не менше 100 -кратної 50 % паралітичної дози в мілілітрі. Якщо препарат провокаційного токсину стабільний, перевірка активності паралітичної дози при кожному визначенні не потрібна.

ПРИГОТУ ВАННЯ РОЗЧИНУ ПРОВОКАЦІЙНОГО ТОКСИНУ

Безпосередньо перед застосуванням провокаційний токсин розводять відповідним розчинником (наприклад, буферним розчином з натрію хлоридом та пептоном рН 7.4) для отримання стабільного розчину токсину, що містить близько 50 -кратної 50 % паралітичної дози в 0.5 мл. Якщо необхідно для визначення активності токсину використовують порції провокаційного токсину розведені в тому самому розчиннику 1:16, 1:50 та 1:160).

РОЗВЕДЕННЯ ВИПРОБОВУВАНОГО ТА СТАНДАРТНОГО ПРЕ ПАРА TIB

Використовуючи розчин 9 г/л натріюхлорида Р, готують розведення випробовуваної вакцини та стандартного препарату, таким чином, щоб для кожного отримати серії розведень, відмінні кроком не більше за 2.5 рази, і в яких проміжні розведення при підшкірній ін'єкції становлять по 0.5 мл на мишу, захищали б близько 50 % тварин від летальних ефектів правцевого токсину, передбаченого для даного випробування.

ІМУНІЗАЦІЯ ТА ПРОВОКАЦІЯ

Розведення розподіляють по 1 на кожну групу мишей та вводять підшкірно по 0.5 мл кожній тварині в групі. Через 28 діб кожній тварині вводять підшкірно по 0.5 мл розчину провокаційного токсину, що містить 50-кратну 50 % паралітичну дозу.

ВИЗНА ЧЕННЯ АКТИВНОСТІ ПРОВОКАЦІЙНОГО ТОКСИНУ

Якщо необхідно, розподіляють 3 розведення провокаційного токсину по одному в 3 групах, що складаються з 5 мишей кожна, і вводять підшкірно кожній ширині по 0.5 мл відповідного розчину.

ОБЛІК ТА ІНТЕРПРЕТАЦІЯ РЕЗУЛЬТАТІВ

Обстежують мишей кожної доби двічі на день. Вилучають та піддають евтаназії всіх тварин у яких

спостерігались ознаки приписного паралічу. Враховують кількість мишей без паралічу через 4 доби після інЧ кпії провокаційного токсину. Розраховують активність випробовуваної вакцини відносно активності стандартного препарату на основі співвідношення тварин з провокацією, без ознак паралічу в кожній з груп вакцинованих мишей, використовуючи звичайний метод статистичного аналі зу (наприклад, 5.3).

ВИМОГИ ДО ПРИДАТНОСТІ ВИЗНАЧЕННЯ

Випробування вважається вірогідним, якщо:

—для випробовуваної вакцини та стандартного препарату 50 % захисна доза знаходиться в інтервалі між найбільшою та найменшою дозами, що були введені мишам;

—де застосовне, що у випадку проведення відповідного випробування кількість паралізованих тварин в 3-х групах, кількістю не менше ніж 5 ін'єкційних розчинів провокаційного токсину, вказує на те, що провокаційна доза була близько 50 -кратної 50 % паралітичної дози;

—довірчого інтервалу (Р = 0.95) складають не менше 50 % та не більше 200 % від установленої активності;

—статистичний аналіз не виявляє значних відхилень від лінійності, паралельності та кривої дозавідповідь (стаття 5. іописує можливі альтернативи при виявленні значних відхилень).

Випробування можна повторити, але при проведенні більше за 1 випробування результати всіх випробувань при розрахунку активності мають бути враховані.

МЕТОД С: ВИЗНАЧЕННЯ АНТИТІЛ У МУРЧАКІВ

ВИБІР ТА РОЗПОДІЛ ВИПРОБОВУВАНИХ ТВАРИН

У випробуванні використовують здорових мурчаків однієї лінії, масою 250-350 г кожна. Використовують мурчаків однієї статі або рівномірно розподіляють самців та самок за групами. Мурчаків розподіляють по не менше як 6 рівних групах; використовують групи, з достатньою кількістю тварин для отримання результатів, що задовольняють вимогам вірогідного аналізу, наведених нижче. Якщо випробуваний провокаційний токсин не стабільний або він недостатньо стандартизований, у випробування включають ще 4 групи з 5 мурчаків в кожній як не вакцинований контроль.

СТА НДАРТНИЙ ПРЕ ПА PA Т

Використовують відповідний стандартний препарат такий, наприклад, як БСП вакцини д.гя профілактики правця (адсорбована) або партію вакцини.

для якої підтверджена ефективність в КЛІНІЧНИХ випробуваннях, або репрезентативну партію, для якої активність розраховано в МО відносно БСП вакцини д/ія профілактики правця (адсорбованої) або міжнародного стандарту для правцевого анатоксину (адсорбованого).

РОЗВЕДЕННЯ ВИПРОБОВУВАНОГО ТА СТАНДАРТНОГО ПРЕПАРАТІВ

Використовуючи розчин 9 г/л натрію хлорида Р, готують розведення випробовуваної вакцини та стандартного препарату; виявлено, що відповідними є серії розведень, відмінні кроком від 2.5 до 5 разів. Використовують не менше 3 розведень в межах, наприклад, 0.5-16 МО/мл для стандартно препарату вакцини та в межах, наприклад, 1:2 та 1:125 для випробовуваної вакцини. Розведення використовують протягом 1 год після приготування. Розподіляють по 1 розведенню на кожну ірупу мурчаків.

ІМУНІЗАЦІЯ

Кожному із дослідних мурчаків вводять підшкірно по 1.0 мл розведення, що відповідає даній групі.

ЗАБІР КРОВІ

Через 35-42 доби після імунізації у кожної вакцинованої та контрольної тварини відповідним методом відбирають пробу крові.

ПРИГОТУВАННЯ ЗРАЗКІВ СИРОВАТКИ

Уникають частих заморожувань та розморожувань зразків сироватки. Для уникнення мікробної контамінації надати перевагу проведення всіх маніпуляцій в ламінарному боксі.

ВИЗНАЧЕННЯ ТИТРУ АНТИТІЛ

Розраховують відносний титр антитіл або число кожного зразка сироватки підхожим імунохімічним методом (2.7.1). Підхожим вважаються методи, наведені нижче (імуноферментний аналіз (ELISA) та інгібування зв'язування токсину або анатоксину (ТоВі).

РОЗРАХУНОК АКТИВНОСТІ

Розраховують активність випробовуваної вакцини в М О відносно стандартного препарату, використовуючи звичайні статистичні методи (наприклад 5.3).

ВИМОГИ ДО ГІРИДА ШОСТІ ВИЗНА ЧЕННЯ

Випробування вважається вірогідним, якщо:

—довірчі інтервали ( Р = 0.95) складають не менше 50 % та не більше 200 % від установленої активності;

І38ДЕРЖАВНА ФАРМАКОПЕЯ УКРАЇНИ і .4

— статистичний аналіз не виявляє відхилень від лінійності, паралельності та кривої доза-відповідь (стаття 5.J описує можливі альтернативи при виявленні значних відхилень).

Випробування можна повторити, але при проведенні більше за 1 випробування результати всіх випробувань при розрахунку активності мають бути враховані.

Нижнє наведений розділ має інформаційний характер

Керівництво: Кількісне визначення вакцини для профілактики правця (адсорбованої)

МЕТОД А: ПРОВОКАЦІЙНИЙ ТЕСТ НА МУРЧАКАХ

ОБЛІК ТА ІНТЕРПРЕТАЦІЯ РЕЗУЛЬТАТІВ

Щоб звести до мінімуму страждання експериментальних тварин, рекомендується звертати увагу на ступінь паралічу, користуючись шкалою, що наведена нижче. Оцінка типових ознак проводиться після підшкірного введення провокаційного токсину, в середину очеревини безпосередньо позаду грудини, при цьому голка повинна бути спрямована у бік шиї мурчака. Стадію ТЗ приймаютьяк кінцеву точку, але якщо експериментально отримані данні, що відповідають стадії Т2, то за кінцеву точку можна прийняти її. Правцевий токсин призводить, по крайній мірі до паралічу 1 з передніх кінцівок, що може бути виявлене в ранній стадії. Стадії правця у мурчаків характеризуються наступними ознаками:

— ТІ: невелика нерухомість 1 передньої кінцівки, але спостереження утруднене;

—Т2: парез 1 передньої кінцівки, що все ще може функціонувати;

—ТЗ: параліч 1 передньої кінцівки, тварини рухаються з небажанням, тіло, часто внаслідок сколіозу, слегка нагадує форму банану;

—Т4: передні кінцівки цілком напружені, пальці нерухомі, спостерігається мускульна контрактура передніх кінцівок, і зазвичай спостерігається сколіоз.

—Т5: напади правця, безперервні тонічні судоми мускулатури;

—D: смерть.

МЕТОД В:ІіРОВОКАЦ1ЙНИЙ ТЕСТ НАМИШАХ

ОБЛІК ТА ІНТЕРПРЕТАЦІЯ РЕЗУЛЬТАТІВ

Щоб звести до мінімуму страждання експериментальних тварин, рекомендується звертати увагу на ступінь паралічу, користуючись шкалою, що на-

135

ведена нижче. Очіпка типових ознак проводиться після введення провокаційного токсину н область спини близько до однієї із задніх кінцівок. Стадію ТЗ приймають як кінцеву точку, але якщо експериментально отримані данні, ию відповідають стадії Т2, то за кінцеву точку можна прийняти її. Правцевим токсин у кінцівці з ін'єкційно введеним токсином призводить до парезу, що супроводжується паралічем. Стадії правця у мишей характеризуються наступними ознаками:

—ТІ: невелика нерухомість в задній кінцівці з введеним токсином, спостерігається лише коли миша піднята за хвіст;

—Т2: парез в задній кінцівці з введеним токсином, що ще може нормально функціонувати при ходьбі:

—ТЗ: парапіч в задній кінцівці з введеним токсином, що не функціонує при ходьбі;

—Т4: задня кінцівка з введеним токсином повністю напружена, пальці нерухомі.

—Т5: напади правця, безперервні тонічні судоми мускулатури;

—D: смерть.

МЕТОД С. ВИЗНАЧЕННЯ АНТИТІЛ У МУРЧАКІВ

ПРИГОТУВАННЯ ЗРАЗКІВ СИРОВА ТКИ

Відповідним методом приготування зразків сироватки вважається метод наведений нижче. Пробірки, що містять зразки крові 6 разів перевертають та інкубують при температурі 37 °С протягом 2 год, потім при температурі 4 °С протягом 2 год. Центрифугують при кімнатній температурі на швидкості 800 g протягом 20 хв. Сироватки переносять в стерильні пробірки та зберігають при температурі нижче -20 °С. При використанні даного методу вихід сироватки складає не менше 40 %.

ВИЗНА ЧЕННЯ ТИТРУ АНТИТІЛ

Нижче наведені приклади підхожих імунохімічних методів визначення титру антитіл — метод ELISA та ТоВі.

Визначення титру антитіл в сироватці мурчаків твердофазним імуноферментним аналізом (ELISA). У планшетах для ELISA покритих дифтерійним анатоксином готують розведення випробовуваної та стандартної сироваток. У кожному планшеті передбачають позитивні та негативні контрольні сироватки мурчаків для моніторингу відтворюваності випробування. До кон'югованих пероксидазою антитіл кроля або кози проти IgG мурчаків, додають субстрат для пероксидази. Вимірюють оптичну густину та розраховують титр антитіл, використовуючи відповідні статистичні методи (наприклад, 5,3).

Реактиви та обладнання:

~Планшети дія EUSA: 96 лунок, 1-12 стовпчиків,

ряліи піл А ло Н.

—• НСП сироватки проти Clostridium tetani (гіля w- стосувоннялюдиною) (інтчіпинна контрольна си-

роватка).

—Пероксидаз/шії кон'югат. Кон'кновані пероксида юк> антитіла кроля або кози проти IgG мурчаків.

—Правцевий анатоксин.

—Карбонатний буфер рН 9.6 для покриття. 1.59 г натрію карбонату безводного Р та 2.93 г натрію гідроксикарбонату /'розчиняють в 1000 мл води Р.

Отриманий розчин розливають у флакони місткістю 150 мл та стерилізують автоклавуванням при температурі 121 °С протягом 15 хв.

—Фосфатно-сольовий буфер рН 7.4 (PBS). 80.0 г натрію хлориду Р, 2.0 г калію гідрофосфату Р,

14.3 г динатрію гідрофосфату дигідрату Р та

2.0 г калію хлориду /'перемішуючи розчиняють в

1000 мл води Р. Зберігають при кімнатній температурі, уникаючи кристалізації. Перед застосуванням розчин розводять 1:9 водою Р.

—Розчин кислоти лимонної. 10.51 г кислоти лимонної Р розчиняють в 1000 мл води Р та доводять рН розчину до 4.0, використовуючи розчин 400 г/л натрію гідроксиду Р.

—Промивний буфер. PBS, що містить 0.5 г/л полісорбату 20 Р.

—Блокуючий буфер. PBS, що містить 0.5 г/л полісорбату 20 Рта 25 г/л сухих вершків.

—Субстрат для пероксидази. Незадовго до використання 10 мг диамонію 2,2'-азинобіс(3-етилбензотіа золін-6-сульфонату) P(ABTS) розчиняють в 20 мл розчину кислоти лимонної. Безпосередньо перед використанням додають 5 мкл водню пероксиду розчину концентрованого Р.

Метод

Нижче як приклад наведено опис розкладки планшету, але можна це провести інакше. Лунки 1А-Н використовують для негативної контрольної сироватки, лунки 2А-Н та 12А-Н для позитивної контрольної сироватки для моніторинга аналізу. Лунки З-11А-Н для випробовуваних зразків.

Кожну лунку планшету для ELISA покривають 100 мкл розчину дифтерійного анатоксину (0.5 Lf/мл в карбонатному буфері рН 9.6) для покриття. Інкубують протягом ночі при температурі 4 °Су вологому середовищі. Щоб уникнути ефектів температурного градієнта не складають у висоту більше 4 планшетів. На наступний день ретельно промивають планшети промивним буфером. Планшети блокують, додаючи в кожну лунку по 100 мкл блокуючого буферу. Інкубують у вологому середовищі при температурі 37 °С протягом 1 год. Планшети ретельно промивають промивним буфером. По 100 мкл блокуючого буферу додають в кожну лунку крім ряду А. Готують відповідне розведення негативної та позитивної контрольних сироваток (близько 0.01 МО/мл), та випробовуваної сироватки. Розподіляють негативну контрольну сироватку по стовпцю 1, позитивну контрольну сироватку по

стовпцях 2 та 12, та випробовувану сироватку по стовпцях 3-11 і додають по 100 мкл кожної сироватки до перших 2 лунок відповідного стовпця. Використовуючи мульти канальну мікропипетку, роблять двократне серійне розведення від ряду В вниз до ряду Н. переносячи по 100 мкл з однієї лунки в наступну. Відбирають 100 мкл з останнього ряду, залишаючи тим самим у всіх лунках по 100 мкл. Інкубують при температурі 37 °С у вологому середовищі протягом 1 год. Ретельно промивають планшети промивним буфером. Готують відповідне розведення (виявлено, що відповідним є 2000-кратне розведення) пероксидазного кон'югату в блокуючому буфері та додають по 100 мкл в кожну лунку. Інкубують при температурі 37 °С увологому середовищі протягом 1 год. Ретельно промивають планшети промивним буфером. До кожної лунки додають по 100 мкл субстрату для пероксидази. Витримують при кімнатній температурі, в захищеному від світла місці протягом 30 хв. Планшети переглядають при довжині хвилі 405 нм в тому самому порядку в якому додавали субстрат.

Визначення титру антитіл в сироватці мурчаків інгібуванням зв'язування токсину або анатоксину (ТоВі). Токсин правця або анатоксин додають до серії послідовних розведень стандартної та випробовуваної сироватки: суміші сироватка/антиген інкубують протягом ночі. Для визначення не зв'язаного токсину або анатоксину, суміші переносять на планшет для EL1SA, покритий протиправцевою сироваткою. До кон'югованого пероксидазою кінського протиправцевого IgG додають субстрат для пероксидазьі. Вимірюють оптичну густину та розраховують титр антитіл, використовуючи звичайні статистичні методи (наприклад, наведені в статті 5.3). Для контролю відтворюваності випробування в кожен планшет включають позитивні та негативні контрольні сироватки.

Реактиви та обладнання:

—Круглодонні тверді планшети для мікротитрування

зполістеролу.

—Плоскодонні планшети для EL1SA.

—Токсин правця або правцевий анатоксин.

—БСП сироватки мурчака проти Clostridium tetani

(для вакцин для застосуваннялюдиною)(позитивна контрольна сироватка).

—Кінський протиправцевий IgG.

—Кон'югований пероксидазою кінський протиправцевий IgG.

—Карбонатний буфер рН 9.6. 1.5 г натрію карбонату безводого Р, 2.39 г натрію гідрокарбонату Рта 0.2г

натрію азиду Ррозчиняють в 1000 мл води Р. Доводят рН до 9.6 та автоклавують гіри температурі

1 2 1 " С

—Ацетатно-натрісвий буфер рН 5.5. 90.2 і натрію ацетату безводого /'розчиняють в 900 мл води Р,

доводять значення рН до 5.5, використовуючи насьнпеїіьш розчин кислоти лимонної моногідрат Р, ДОІІПДИТ Ь об'єм водою Рдо 1000 мл.

—Фосфшшш-сольовий буфер рН 7.2 (PBS). 135.0 г натрію xjiopudy Р, 20.55 г (іинатрію гідрофосфапт

І38ДЕРЖАВНА ФАРМАКОПЕЯ УКРАЇНИ і .4

дигідрату та 4.S0 г натрію дигідрофосфат моногідрат Ррозчиняютьувог)/' Рга доиодип.до І5лтим же розчинником. Антоклануют мри температурі 100 °С протягом 60 хв.

—Буфер для розведення. PBS, що містить 5 г/л аіьбуміну бичачого Р та 0.5 г/л полісорбату 80 Р.

—Блокуючий буфер. PBS, що містить 5 г/л а>іьбуміну бичачого Р.

—Розчин тетраметшібензидину. 6 г/л тетраметилбензидину /'розчиняють в 96%спирті Р. Речовина розкладається протягом 30-40 хв при кімнатній температурі.

—Субстрат для пероксидази. Змішують 90 мл води Р, 10 мл ацетатно-натрієвого буферу рН 5.5, 1.67 мл

розчину тетраметилбензидину та 20 мкл водню пероксиду розчину концентрованого Р.

—Промивний розчин. Водопровідна вода, шо містить

0.5г/л полісорбату SO P.

Метод

Планшети для мікротитрування блокують, поміщаючи в кожну лунку по 150 мкл блокуючого буферу. Накривають планшети кришкою або іншим відповідним засобом. Інкубують у вологому середовиші при температурі 37 °С протягом 1 год. Планшети ретельно промивають, використовуючи промивний розчин. Поміщають 100 мкл PBS в кожну лунку. Поміщають 100 мкл стандартної протиправцевої сироватки мурчаків в першу по рахунку лунку в ряду. Помішають 100 мкл не розбавленої випробовуваної сироватки в першу по рахунку лунку наступного ряду/ів (необхідну кількість разів). Використовуючи мультиканальну мікропіпетку, роблять двократне серійне розведення упоперек планшету (до колонки 10), переносячи по 100 мкл з однієї лунки в наступну. Видаляють 100 мкл з останнього ряду, залишаючи тим самим у всіх лунках по 100 мкл. Готують 0.1 Lf/мл розчин токсину правця або анатоксину, використовуючи PBS як розчинник. Додають40 мкл цього розчину в кожну лунку окрім лунок колонки 12. Лунки колонки 11 - це позитивний контроль. Додають 40 мкл PBS в лунки колонки 12 (негативний контроль). Планшети обережно струшують та накривають їх кришками. Покриття планшетів для ELISA: безпосередньо перед використанням роблять відповідне розчинення кінського протиправцевого IgG в карбонатному буфері рН 9.6 га додають 100 мкл в кожну лунку. Інкубують 2 паралелі планшетів протягом ночі у вологому середовищі при температурі 37 °С. Щоб уникнути ефектів температурного градієнта не складають у висоту більше 4 планшетів. Накривають планшети кришками. Наступного дня ретельно промивають планшети для ELISA промивним розчином. Блоку ють планшети, поміщаючи в кожну лунку 125 мкл блокуючого буфера. Інкубують у вологому середовищі при температурі 37 °С протягом І год. Ретельно промивають планшети для ELISA промивним розчином. Переносять НН) мкл суміші після інкубації з планшета для мікроїитруианмя у відповідні лунки планшету

135

для EL1SA, починаючи з колонки 12 і потім продовжуючи від 1 до 11. Накривають планшети кришкою. Інкубують при температурі 37 °С у вологому середовищі протягом 2 год. Ретельно промивають планшети для ELISA, використовуючи промивний розчин. Роблять відповідні розведення (раніше було виявлено, що відповідним є 4000-кратне розведення) кон'югованого пероксидазою кінського протиправцевого IgG в буфері для розведення. У кожну лунку додають 100 мкл розчину та накривають планшети кришкою. Інкубують при температурі 37 °С у вологому середовищі протягом 1.5 год. Ретельно промивають планшети для ELISA, використовуючи промивний розчин, у кожну лунку додають 100 мкл субстрата для пероксидазьі; з'являється синє забарвлення. Інкубують планшети при кімнатній температурі. Зупиняють реакцію у встановлений термін (в межах 10 хв) додаванням 100 мкл 2 М розчину кислоти сірчаноїР в кожну лунку з вже доданим субстратом; забарвлення повинне змінитися від синього в жовтий. Негайно після додавання кислоти сірчаної Р вимірюють оптичну густину при довжині хвилі 450 нм або тримають планшети в темному місці до вимірювання.

користовують як невакцинований контроль і кожній тварині цієї групи підшкірно вводять таку саму кількість розчинника. Через 28-32 доби проводять анестезію тварин і їх знекровлення, одержуючи індивідуальну сироватку від кожної миші. У кожній індивідуальній сироватці підхожим імунохімічним методом (2.7.1) кількісно визначають специфічні антитіла до вірусу гепатиту А.

Розрахунки. Розрахунок проводять звичайними статистичними методами для кількісного визначення з використанням методу пробітів (5.3).

Із розподілу рівнів реакцій, виміряних у всіх сироватках невакцинованої групи, визначають рівень максимальної реакції, яку можна очікувати у невакцинованої групи для даного конкретного випробування. Будь-яка відповідь вакцинованих тварин, шо перевищує цей рівень, указує на сероконверсію.

Проводять підхоже перетворення відсотка тварин, шо проявляють сероконверсію в кожній групі (наприклад, пробіт трансформацію), й аналізують результати відповідно до моделі паралельних ліній для log доза-відповідь. Визначають активність випробовуваного препарату відносно стандартного препарату.

2.7.14.КІЛЬКІСНЕ ВИЗНАЧЕННЯ ВАКЦИНИ ДЛЯ ПРОФІЛАКТИКИ ГЕПАТИТУ А

Кількісне визначення вакцини для профілактики гепатиту А проводять або in vivo шляхом порівняння здатності вакцини та стандартного препарату в певних умовах індукувати утворення специфічних антитіл у мишей, або in vitro імунохімічним визначенням вмісту антигена.

КІЛЬКІСНЕ ВИЗНАЧЕННЯ IN VIVO

Нижче як приклад наведений метод випробування на мишах, що вважається придатним для даної вакцини; можуть також використовуватися інші валідовані методи.

Вибір і розподіл випробовуваних тварин. У випробуванні використовують здорових мишей, придатних для випробування ліній і одного приплоду, близько п'ятитижневого віку. Використовують тварин однієї статі. Тварин нарівно розподіляють у 7 груп, кількість тварин в яких відповідає вимогам випробування.

Умови придатності. Результати випробування вважаються невірогідними, якщо:

—EDj0 для випробовуваної і стандартної вакцин не знаходиться між найменшою і найбільшою дозою, одержаною твариною;

—статистичний аналіз показує значні відхилення від лінійності або паралельності;

—довірчий інтервал (Р—0.95) менше 33 % і більше 300 % від установленої активності.

Вимоги до активності. Верхній довірчий інтервал (Р—0.95) установленої відносної активності складає не менше 1.0.

КІЛЬКІСНЕ ВИЗНАЧЕННЯ IN VITRO