8. Частота появления различных аномалий и болезней пчелиных маток

Читателя может интересовать, насколько часто в процентном соотношении проявляются различные аномалии и болезни пчелиной матки. Помещенная ниже таблица дает суммарное заключение по этому вопросу ; оно опирается на 3921 данных, полученных мною при анатомических и микроскопических исследованиях 3415 анормальных маток, которых в течение нескольких лет присылали в отдел пчеловодства в Либефельде швейцарские и некоторые иностранные пчеловоды.

Если в этой таблице численно значительно больше данных, чем исследованных маток, то это объясняется тем, что у некоторых особей удалось обнаружить по две и более аномалии или болезни. Как показывает этот обзор, трутовочность можно считать важнейшим нарушением нормальной воспроизводительной деятельности пчелиной матки. Относительно часты также заболевания пищеварительного тракта и половых органов. Во всяком случае они играют более значительную роль, чем внутренние аномалии, при которых дело идет об интересных для науки, но не имеющих значения для практики нарушениях развития. Но было бы неверно, не уделять им, а также всем остальным болезненным явлениям и аномалиям никакого внимания, потому что только всеобъемлющее и основательное знание всех причин заболеваний и аномалий дает возможность поставить правильный диагноз. Пчеловоды могут внести в это большой вклад, если они не просто устраняют больных и анормальных маток, а по - возможности живыми предоставляют их в распоряжение ученых специалистов для исследования.

9. Методы исследования

Для лабораторий, которые хотят заниматься изучением пчелиных маток, полезно дать некоторые указания.

9.1. Посылать живых пчелиных маток с 10 - 20 сопровождающими пчелами лучше всего в подсадочных клеточках, обычных для пчеловодной практики. В качестве корма годится только медово-сахарное тесто, но не жидкий мед, потому что во время пути, пчелы могут так выпачкаться в нем, что матка вместе с ними погибает. Присланных мертвыми маток можно в большинстве случаев исследовать только в отношении осеменения и поражений нозематозом или клещами, так как посмертное разложение внутренних органов особенно в теплое время года происходит так быстро, что более подробные исследования невозможны.

9.2. Вспомогательные средства для анатомического исследования

Живых пчелиных маток перед анатомическим исследованием глубоко 'наркотизируют парами этилового эфира, т.е. практически умерщвляют. В качестве сосуда для наркоза пригодны небольшие стеклянные баночки с кусочком ваты внутри ; последнюю накрывают тонкой проволочной сеточкой и капают на нее эфиром.

Для вскрытия требуется или, во всяком случае, желательно иметь:

Бинокулярный препаровальный микроскоп с 10—20-кратным увеличением с соответствующим препаровальным столиком и подвижным сильным осветителем (например, низковольтовой лампой с трансформатором и отражателем).

Препаровальные чашки: чашки Петри диаметром 9 см, которые наполовину высоты залиты смесью воска с парафином.

Инструменты для вскрытия : тонкие ножницы, скальпели, ланцеты и тонкие ножички, используемые при глазных операциях ; острые пинцеты часовщика (например, фирмы Думон и сыновья, № 5); препаровальные иглы с прямыми и загнутыми концами; энтомологические булавки различной длины и толщины.

Жидкости для исследования:  0,65% ный физиологический раствор поваренной соли или ригеровский раствор для насекомых (состав: NC1 -  0,75 г, КС1 - 0,35 г, СаС12 - 0,0021 г, дистиллированная вода 100 см³),

9.3. Анатомическое исследование

Для установления возможных внешних аномалий пчелиных маток сначала тщательно осматривают дорзально (сверху) и вентрально (снизу) и при небольшом увеличении ; только потом их расчленяют.

Для вскрытия матку фиксируют брюшной стороной вниз при помощи двух энтомологических булавок в препаровальной чашке. Сначала булавкой (рис. 181, № 1) протыкают грудь. Затем вводят вторую булавку сзади в камеру жала и закрепляют последний абдоминальный стернит, слегка вытягивая брюшко на ложе.

Вскрытие брюшка производят, делая два разреза ножницами. Первый разрез (S1) идет от камеры жала с левой стороны тела между тергитами и стернитами до переднего брюшного сегмента, тергит которого отделяется вторым разрезом (S2) слева направо. Абдоминальный спинной покров затем целиком отводится пинцетом направо и закрепляется на парафиновой подушке несколькими энтомологическими булавками. Таким простым способом можно обнажить все органы брюшка в их естественном положении. Это удается гораздо лучше, чем если вскрытие производится с брюшной стороны. Дальнейшее препарирование значительно облегчается добавлением физиологического раствора поваренной соли или раствора Рингера.

Для обнажения органов головы, особенно мозга, при помощи поперечного среза удаляют часть головного хитина позади простых глазков и затем лобную часть головной капсулы до клипеуса, причем твердые относящиеся к внутреннему скелету передние руки тенториума нужно отделять очень осторожно.

В груди в первую очередь исследуют крупные выходящие из первой сегментной пары трахеи, прежде всего тогда, когда пчелиная матка больна или подозревается больной клещевой болезнью. После удаления головы и эпистернума эти трахеи легко обнажаются и отпрепаровываются для микроскопического исследования.

9.4. Гистологическое исследование

Если необходимо приготовить гистологические препараты внутренних органов пчелиных маток, их приходится фиксировать в совсем свежем (живом) состоянии. Рекомендуется эту фиксацию органов производить после сливания применявшейся при исследовании жидкости в препаровальной чашке in situ, то есть в их естественном положении. Приблизительно через 30 минут объекты освобождают от парафиновой подушки и целиком перекладывают в наполненный такой же фиксирующей жидкостью небольшой стеклянный сосуд, дно которого предварительно было уложено фильтровальной бумагой. Дальнейшее препарирование, особенно удаление хитиновых частей, лучше производить только тогда, когда объекты основательно промыты после фиксирования в 70 - 95% спирте. Обилие в органах заполненных воздухом трахей приводит к тому, что водные фиксирующие жидкости проникают в них значительно хуже, чем содержащие алкоголь смеси. Этот недостаток можно преодолеть, производя фиксацию в эксикаторе с боковым тубусом и краном при очень осторожной эвакуации.

В качестве фиксирующих жидкостей, исходя из опыта автора, рекомендуются следующие:

Гейденхайнская Susa-смесь

Состав: сублимата 4,5 г, поваренной соли 0,5 г, дистиллированной воды 80 куб. см., трихлоруксусной кислоты 2,0 г, ледяной уксусной кислоты 4,0 куб. см, формалина 20 куб. см. Продолжительность фиксации от одного до нескольких часов, затем непосредственное перенесение в 90%-ный этиловый спирт, десублимация в спиртовом растворе йодистого калия 2:3 : 100.

Смесь Буэна

Состав : насыщенный водный раствор пикриновой кислоты 15 куб. см, 10%-ный формалин 5 куб. см, ледяная уксусная кислота 1 куб. см, продолжительность фиксации 2 - 3 часа, затем основательное промывание в 70% этиловом спирте.

Смесь Карноу

Состав: чистый этиловый спирт 60 куб. см, хлороформ 30 куб. см, ледяная уксусная кислота 10 куб. см. Продолжительность фиксации 1- 3 часа, затем положить прямо в 95 % или абсолютный этиловый спирт. При слишком долгом фиксировании объекты легко затвердевают и становятся хрупкими.

Смесь Леовена

Состав: 1% пикриновая кислота в абсолютном этиловом спирте 12 частей, 40% формалин 2 части, хлороформ 2 части, ледяная кислота 1 часть. Продолжительность фиксации 6 - 12 часов, затем промывание в 70 - 90% спирте.

Смеси Карноу и ван Леовена особенно пригодны для исследований гликогена.

Заливка фиксированных спиртам повышающейся концентрации, полностью обезвоженных объектов лучше всего удается через метилбензолат или бензол, в парафине (точка плавления примерно 55 - 58°С).

Выбор способа окраски зависит от того, что требуется представить или доказать. Для обзорных препаратов применяют двойное окрашивание ледяными гематоксилином Вейгерта и эозином или флоксином, а также азокарминным методом Гейденхайна.

Для выборочного выявления характерных для болезненной трутовочности маток зернистых включений наиболее пригодна, окраска по способу Манна метиленовой синью и эозином. Освобожденные от парафина в ксилоле и проведенные через спиртовые растворы уменьшающейся

концентрации в дистиллированную воду срезы выдерживают в течение часа в следующей красящей смеси:

 

 

1% водный раствор метиленовой сини  35 куб. см

1% водный раствор эозина                      35 куб. см

дистиллированная вода                          100 куб. см

Срезы затем хорошо прополаскивают в дистиллированной воде, ненадолго перекладывают в 70 -95% спирт и обычным способом через абсолютный спирт и ксилол заключают в канадский бальзам. Специфические зернистые включения окрашиваются в ярко-красный, ткани - в синий цвета. Если речь идет о том, чтобы в мазках или срезах ткани были отчетливо и контрастно видны бактериальные или грибковые возбудители болезни, то достигнуть этого проще всего модифицированным способом окраски по Клаудиусу. Он основан на принципе метода Грама и применяется для высушенных на воздухе фиксированных на пламени мазков или для освобожденных от парафина срезов ткани, проведенных через ряд спиртовых растворов уменьшающейся концентрации в дистиллированную воду, следующим образом: 1) окраска в отфильтрованном, 1% водном растворе метилфиолета 63: 2 - 5 минут. 2) краткое прополаскивание в дистиллированной воде, очень осторожная просушка тонкой фильтровальной бумагой; 3) травление в смеси из 8 частей полунасыщенной водной пикриновой кислоты и 2 частей 1% водного раствора истинно красного Дуро (Duroechtrot) 2 - 3 минуты; 4) быстрое промывание дистиллированной водой, снова обсушивание фильтровальной бумагой;

5) дифференциация в хлороформе, анилиновом масле, или в одной из следующих смесей: абсолютный этиловый спирт -  хлороформ 1:1; абсолютный этиловый спирт -  анилиновое масло 2 : 1 или 3:1, абсолютный этиловый спирт - ацетон 2:1. Дифференциацию производят до тех пор, пока препарат на просвет не окажется равномерно красной окраски;

6) помещение препарата в ксилол (2 - 3 порции) и, наконец, в канадский бальзам.

Грам-положительные микробы окрашиваются в ярко синий до иссиня-черного цвета, а ткани - в различной интенсивности красный. Вместо метилфиолета можно применять карбофуксин. Для травления в этом случае используют смесь из 8 частей полунасыщенной пикриновой кислоты и 2 частей 1% водного раствора синей краски для шерсти или воднорастворимого анилинового синего. Микробы тогда становятся интенсивно красными, ткани — голубыми. Такие препараты используются преимущественно для микрофотографирования и отличаются большой устойчивостью.

9.5. Взятие крови

Для взятия пробы крови с помощью тончайших стеклянных капилляров на теле матки пригодны две точки, а именно, затылочная часть головы позади простых глазков и в брюшке - через межсегментную оболочку между третьим и четвертым стернитами. Головная капсула после раздвигания волосков и смачивания спиртом открывается при помощи поперечного разреза ножницами или маленьким ланцетом. Для приготовления мазков гемолимфы не нужно отсасывать скапливающуюся в ранке кровь, так как она сама втягивается в капилляры. Затем можно выдуть ее на предметное стекло, предварительно основательно очищенное и обезжиренное смесью эфира со спиртов и размазать тонким слоем краем чистого покровного стеклышка. При введении стеклянного капилляра между приподнятыми пинцетом брюшными чешуйками необходимо следить за тем, чтобы он после прокалывания межсегментной оболочки проникал только в периневральный синус и не повреждал пищеварительный тракт.

Для фиксации высушенных на воздухе мазков крови пригоден абсолютный метиловый спирт (продолжительность фиксации 2—3 минуты). Мазки можно окрасить по методу Гимзы или смесью Манна — метиленовой синью с эозином. Для доказательства наличия бактериальных или грибковых микроорганизмов в крови хороший результат дает окрашивание по модифицированному методу Клаудиуса.

9.6. Метод прививки

При исследовании инфекционных болезней пчелиной матки может быть желательно или необходимо ввести в гемолимфу здоровой матки возбудителей болезни, изолированных из поврежденных органов или выращенных с этой целью на питательных средах. Так как пчелы большей частью плохо переносят инъекции, рекомендуется метод прививки, разработанный автором, который дал хорошие результаты. Пчелиную матку, усыпленную парами эфира или углекислоты кладут брюшной частью вниз в препаровальную чашку и закрепляют на парафиновой подушке при помощи двух загнутых энтомологических булавок за шейную часть и позади груди. В качестве места инъекции пригоден панцырь среднегруди , который маленьким шабером очищается от опушения и осторожно смачивается спиртом. Под препарационным микроскопом наносят затем в панцыре глазным хирургическим ножом примерно трехмиллиметровую полукруглую рану, приподнимают острым пинцетом подрезанный так кусочек хитина и вводят инфекционный материал в ранку и вместе с тем в кровь. После опускания хитинового полукруга ранку закрывают хорошо удерживающимся, эластичным клеющим средством, например каучуковым молоком («Dartex»). Коллодий и мастика для этого не пригодны, потому что закрытые с их помощью раны после высыхания легко раскрываются. Привитую пчелиную матку после пробуждения от наркоза в подсадочной клеточке возвращают в ее семейку-воспитательницу.