1 Этап эсми. Взятие и обработка материала.

К выполнению экспериментальных исследований на животных допускаются лица, имеющие высшее медицинское, медико-биологическое, фармацевтическое, ветеринарное, зоотехническое или биологическое образование, после того как они освоили правила обращения с лабораторными животными и приобрели практические навыки.

Материал для исследования забирается в асептических условиях, в стерильную посуду, гомогенизируется и используется для заражения возможно быстрее.

2 Этап эсми. Выбор и заражение лабораторного животного.

Выбор лабораторного животного. В медико-биологических исследованиях используется около 250 видов животных.

Нелинейные животные. Одни виды постоянно разводят в лабораториях, питомниках и предприятиях по производству биопрепаратов, это так называемые лабораторные животные: белые мыши, белые крысы, морские свинки, кролики, хомяки, кошки, собаки, обезьяны, бараны, лошади. Других животных периодически отлавливают для эксперимента (полевки, песчанки, суслики, хорьки, сурки, лемминги). От общего числа лабораторных животных на долю белых мышей приходится около 70%, белых крыс – 15%, морских свинок – 9%, кроликов – 2%.

Линейные животные. Методом тесного инбридинга (внутриродственного скрещивания) удалось вывести более 200 линий мышей, свыше 20 линий крыс, 7 линий морских свинок, несколько линий кроликов. Среди диких животных чистых линий не существует. На выведение линий затрачивается не менее 8–10 лет тщательно выполняемой работы. С целью выведения определённой линии лабораторных мышей, крыс или других животных осуществляют братско-сестринское скрещивание на протяжении более 20 последовательных поколений и лишь тогда достигают 100% гомозиготности. Линейные (инбредные) животные ценны тем, что являются генетически однородными и отличаются от нелинейных животных постоянными реакциями на воздействие физиологических, химических и патогенных факторов. Каждой линии присущи свои передающиеся по наследству особенности и свойства (повышенная или пониженная чувствительность к возбудителям инфекционных заболеваний, опухолям). По рекомендации международного комитета по стандартизации генетической номенклатуры названия линий пишутся заглавными латинскими буквами. В заглавии линии заложено её происхождение, год создания какой-либо особенности животных данной линии. Напр., среди белых мышей наиболее распространены линии A, CBA, BALB, BAJJ, C57BL, C57BR, C58, C3H.

Линейные лабораторные животные очень чувствительны к неблагоприятным факторам окружающей среды, поэтому условия содержания их должны быть лучше, чем нелинейных животных.

Потомство линейных животных, у которых в силу различных причин прекращено разведение методом инбридинга теряет линию, так как у них накапливаются мутации, а гомозиготность понижается. Уменьшение гомозиготоности при этом прогрессирует от поколения к поколению, а специфические для данной линии признаки могут быть потеряны, ослаблены или извращены.

Животные-гнотобионты и животные-гнотофоры. Как линейные, так и нелинейные животные являются носителями возбудителей многих вирусных, бактериальных, грибковых заболеваний, которые затрудняют выполнение точных исследований. В процессе эксперимента, особенно длительного, присутствующие в организме животного возбудители могут активироваться и извратить характер реакции на испытуемый агент. В связи с этим возникла потребность получения лабораторных животных, лишённых микроорганизмов (гнотобионтов) или имеющих в организме контролируемую микрофлору (гнотофоры). Животных-гнотобиотов получают от беременных самок, которым проводят кесарево сечение в определённый период перед родами. Новорожденных помещают на утеплённые подстилки в клетки. Корм, воду, подстилку и другие материалы, необходимые для обеспечения жизнедеятельности безмикробных животных, подвергают стерилизации в автоклавах. Животных-гнотобиотов содержат в стерильных условиях в течение всей их жизни. В гнотобиотических изоляторах получены безмикробные мыши, крысы, морские свинки, хомячки, кролики, кошки, собаки, ягнята, козлята, поросята, обезьяны.

Выбор вида, линии, возраста и пола животных диктуется целями исследований. Отобранных животных тщательно осматривают, больных выбраковывают. Перед проведением эксперимента все животные должны быть выдержаны в виварии на 2-х недельном карантине.

Животные, взятые в эксперимент, должны быть здоровы, чувствительны к предполагаемому возбудителю, однородны по породе, линии, массе, возрасту, полу, упитанности, промаркированы.

Основные способы маркировки лабораторных животных:

– татуировка ушей тушью у животных, имеющие большие непигментированные ушные раковины (кролики, свинки, крысы, мыши);

– мечение мышей и крыс краской (насыщенным раствором пикриновой кислоты, 0,5% раствором генцианвиолета, фуксином, эозином);

– с помощью колец или жетонов из мягкой белой жести, которые закрепляют на ушах или лапках (так маркируют новорожденных лабораторных животных).

Фиксация животных при проведении исследований.

Кролики отличаются от других лабораторных животных спокойствием и относительно слабым сопротивлением при фиксации. Для фиксации их привязывают к специальным станкам или столам. Следует иметь в виду, что при сильном запрокидывании головы у кроликов легко наступает смерть от удушья. Помощник может зафиксировать кролика двумя руками: левой рукой за кожу спины в области затылка, правой – за кожу в области крестца. Кролика можно опеленать куском прочной материи. Удобен также способ фиксации с помощью индивидуального иммобилизационного станка, ящика с круглой прорезью в передней стенке.

Фиксация морских свинок не представляет затруднений. Левой рукой животное удерживают за спину и грудь так, чтобы большой и указательный пальцы охватывали шею, а другие пальцы передней руки обездвиживали передние конечности и ограничивали движения головы, правой рукой снизу удерживают заднюю часть тела и обездвиживают животом вверх.

Фиксация белых крыс обычно является наиболее сложной. Животное берут за кожу спины или хвост. Помощник левой рукой берет крысу за кожу в области затылка и фиксирует этим голову и передние конечности, а правой рукой удерживает задние конечности и хвост. После этого животному придают нужное положение. Для фиксации крыс предложен ряд приспособлений – сетки, цилиндры, гильзы.

У белой мыши захватывают кожу спины на затылке большим и указательным пальцами левой руки, а остальными пальцами этой же руки удерживают задние конечности и хвост. Эти же манипуляции можно выполнять раздельно двумя руками. Фиксированное животное располагают в нужном положении.

Методы заражения лабораторных животных.

Применяют следующие методы заражения животных: накожный, внутрикожный, подкожный, внутримышечный, внутривенный, пероральный, интраназальный, внутриполостной (в брюшную полость, в грудную полость, в переднюю камеру глаза), внутриорганный (в мозг, в лёгкие).

Способ заражения зависит от вида материала, вида животного, тропизма микроба.

Участок кожи, где проводится манипуляция, обрабатывают в такой последовательности:

• выщипывают или выстригают (выбривают) шерсть;

• удаляют остатки шерсти депилятором;

• участок кожи подвергают антисептической обработке одним из способов (спиртом, спиртом в смеси с эфиром 1:1, 10% настойкой йода).

Материал вводят с соблюдением правил асептики. При болезненных вмешательствах предварительно проводят анестезию.

Накожный метод. На кожу спины или живота, освобождённую от шерсти, наносят царапины скарификационной иглой. Материал берут стеклянной палочкой и втирают досуха.

Внутрикожный метод. Местом введения обычно выбирают кожу спины или живота. Шерсть на этом месте за два дня до опыта удаляют депилятором. Используют очень тонкие и острые иглы с пологим скосом. Иглу вводят в кожу под очень острым углом скосом вверх. Инъецируют до 0,1 мл раствора. Образовавшееся вздутие («лимонная корочка») не исчезает 3–5 минут.

Подкожный метод. Иглу шприца вводят в основание кожной складки предполагаемого места инъекции. После прокола кожи направление иглы меняют и медленно вводят жидкость – мышам не более 1,0 мл, морским свинкам и крысам –1,5 мл, кроликам –3,0 мл, место введения обрабатывают антисептиком. Следят за тем, чтобы введенный материал не вытекал наружу.

Внутримышечный метод. Лучшим местом введения считается участок с развитым мышечным слоем в области верхней трети задней лапы животного. Острие иглы направляют почти перпендикулярно участку.

Внутривенный метод. Инъекцию производят в краевую вену уха кроликов, яремную вену морских свинок, хвостовую вену крыс или мышей. Обрабатывают кожу над веной. Для лучшего наполнения вены ее пережимают ниже будущего введения или кожу обогревают теплой (55⁰С) водой. Материал вводят медленно.

Пероральный метод. Объём жидкости, вводимой перорально, зависит от вида и возраста животного.

Кроликов и морских свинок пеленают и располагают в положении, близком к вертикальному. Материал вводят принудительно с помощью тонкого эластичного зонда. Процесс введения зонда требует навыков. Перед введением зонда животному вставляют роторасширитель с отверстием в середине. Продвижение зонда по пищеводу обычно не вызывает затруднений, если его конец смазан вазелином, а у животного вызывают глотательные движения закапыванием в рот нескольких капель воды. Через воронку или шприц жидкость вливают в желудок.

Крыс или мышей помощник фиксирует в вертикальном положении, рот открывают браншами пинцета. Жидкость можно вводить двумя способами: а) шприцем со специальной изогнутой иглой, конец которой утолщен в виде шарика с боковым отверстием; б) шприцем с обычной иглой, на которую насажен тонкий эластичный зонд.

Интраназальный метод. Животное фиксируют, с помощью эфира или хлороформа вызывают состояние лёгкого наркоза. Материал вводят в нос животному маленькими каплями шприцем и иглой с насаженным тонким зондом. Материал можно капать непосредственно на нос животного, контролируя его попадание в носовые ходы.

Внутрибрюшинный метод. Инъекцию производят в задней трети живота. Место введения обрабатывают антисептиком до и после инъекции. Животное располагают вниз головой или в наклонном положении. Несколько отступив от средней линии, брюшную стенку прокалывают, вводят иглу под тупым углом к стенке. Игла должна быть с притупленным концом во избежание повреждения внутренних органов.