- •Методы исследования в микробиологии
- •Техника безопасности при работе с биологическим материалом
- •Характеристика уровней биобезопасности
- •Забор, хранение и транспортировка материала для микробиологического исследования
- •Микроскопический (бактериоскопический) метод исследования (бсми)
- •1 Этап бсми. Забор, хранение и транспортировка материала.
- •2 Этап бсми. Приготовление микропрепаратов.
- •1) Препараты, позволяющие изучать микроорганизмы в убитом состоянии:
- •Препараты, позволяющие изучать микроорганизмы в живом состоянии:
- •Сложные методы окраски клеточных структур бактерий
- •Сравнение электронного и светового микроскопов
- •4 Этап бсми. Заключение.
- •Культивирование микроорганизмов на питательных средах
- •Классификации питательных сред
- •I. По происхождению:
- •II. По составу:
- •III. По консистенции:
- •IV. По назначению:
- •Наиболее часто используемые индикаторы рН в питательных средах
- •Среды для получения изолированных колоний.
- •Среды для накопления чистой культуры.
- •Среды для идентификации микроорганизмов.
- •Признаки колоний микроорганизмов
- •Методы выделения чистых культур аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов
- •I. Методы механического разобщения бактерий.
- •Методы выделения чистых культур облигатно-анаэробных микроорганизмов
- •Культуральный (бактериологический) метод исследования
- •I. Этапы блми при выделении чистой культуры аэробов и факультативных анаэробов.
- •1 Этап.
- •2 Этап.
- •3 Этап.
- •Признаки, учитываемые при идентификации микроорганизмов (критерии вида)
- •4 Этап.
- •II. Этапы блми при выделении чистой культуры облигатных анаэробов.
- •1 Этап.
- •2 Этап.
- •Биохимическая идентификация микроорганизмов
- •Идентификация микроорганизмов без выделения чистой культуры
- •Принципы молекулярно-генетического анализа
- •Классификация молекулярно-генетических методов
- •Методы, основанные на изучении фрагментов днк.
- •Методы, основанные на гибридизации нуклеиновых кислот.
- •III. Методы, основанные на амплификации нуклеиновых кислот.
- •Характеристика стадий пцр
- •IV. Методы анализа амплифицированных фрагментов.
- •V. Методы, основанные на определении последовательности нуклеотидов в днк, рнк и аминокислот в белках.
- •VI. Методы, основанные на модификации генетической информации.
- •Характеристика штаммов e. Сoli, участсвующих в процессе конъюгации
- •Определение факторов патогенности бактерий
- •5. Капсула.
- •7. Изучение неизвестных токсинов и других факторов патогенности микроорганизмов, механизмы действия которых недостаточно изучены.
- •Методы изучения чувствительности бактерий к антибиотикам
- •Классификация методов определения
- •Основные понятия
- •Дискодиффузионный метод
- •Пропорционален антибиотикочувствитель-ности микроорганизма
- •Метод разведений в агаре
- •Метод разведений в жидких средах
- •Ускоренный метод
- •Автоматизированнный метод с использованием автоматических микробиологических анализаторов
- •Генетические методы
- •Состав питательной среды:
- •Величина посевной дозы и состояние тест-микроорганизмов (инокулюм-эффект):
- •Условия инкубации:
- •Биологический (экспериментальный) метод исследования
- •1 Этап эсми. Взятие и обработка материала.
- •2 Этап эсми. Выбор и заражение лабораторного животного.
- •3 Этап эсми.
- •Общие принципы серологического метода исследования
- •Определение активности гуморального поствакцинального индивидуального или коллективного иммунитета;
- •Определение титров диагностических, лечебных и профилактических сывороток;
- •I. Достоинства слми:
- •II. Недостатки слми:
- •Наличие ложных результатов:
- •Общие принципы аллергологического метода исследования
- •I этап алми. Сбор аллергологического анамнеза с целью:
- •Достоинства алми:
- •II. Недостатки алми:
- •Оглавление
Идентификация микроорганизмов без выделения чистой культуры
Идентификация без выделения чистой культуры микроорганизмов необходима для детекции возбудителей непосредственно в биологическом материале, что позволяет проводить экспресс-диагностику заболеваний, а также выявлять некультивируемые микроорганизмы. Используют два подхода: генетический и серологический.
А. Генетический. Применяют молекулярно-генетические методы (ПЦР, гибридизацию, секвенирование). Являются перспективными для идентификации любых микроорганизмов и определения устойчивости к противомикробным препаратам (бактерий, вирусов), что обусловлено крайне высокой чувствительностью и быстротой получения результатов. Широко используют для идентификации длительно культивируемых бактерий (микобактерии туберкулёза), облигатных внутриклеточных паразитов (хламидий), возбудителей менингитов, а также вирусов (ВИЧ и вирусов гепатитов). Предполагается, что в будущем эти методы станут основными в диагностике.
В. Серологический. Применяют высоко специфические серологические реакции: РИФ, ИФА. Наибольшее распространение данное направление получило для:
а) идентификации в РИФ некоторых возбудителей заболеваний, передаваемых половым путём (хламидии, микоплазмы, уреаплазмы);
б) идентификации в ИФА антигенов вируса гепатита В и антигенов ВИЧ.
Принципы молекулярно-генетического анализа
В конце 90-х годов XX века в диагностике инфекционных заболеваний ведущее место заняли молекулярно-генетические методы исследования, основанные на изучении биомолекул ДНК, РНК, белков в составе клеток (табл. 10). Они расширили представления:
– о структуре и регуляции функций живого;
– о происхождении микроорганизмов и их эволюции;
– о молекулярном патогенезе заболеваний;
– о возможности диагностики и лечения заболеваний.
Сферы использования молекулярно-генетических методов в микробиологии:
Диагностика инфекционных заболеваний. Маркёром возбудителя является его геном, а именно видоспецифические генетические участки, по которым определяют присутствие определенного вида микроорганизма в клиническом материале (идентифицируют микроорганизмы). Например, IS 6110 есть только у микобактерий туберкулеза, поэтому выявление IS 6110 дает прямое указание на присутствие возбудителя туберкулеза.
Химиотерапия и химиопрофилактика инфекционных заболеваний. Молекулярно-генетические методы широко используются для выявления маркеров резистентности генов резистентности, либо мутаций в генах. Определение устойчивых к b-лактамным антибиотикам стафилококков проводят по наличию в их геноме гена mecA, энтеробактерий (E. coli и K. pneumoniae) и Pseudomonas aeruginosa – по генам tem, shv, oxa. Выявление резистентности к рифампицину у Mycobacterium tuberculosis проводят по мутациям в rpoB гене.
Санитарная микробиология. Молекулярно-генетические методы позволяют выявлять инфекционные агенты в пищевых продуктах, тем самым контролировать их качество, или расследовать причину пищевых отравлений. Эти методы позволяют определять генетически модифицированные пищевые продукты, а также проводить детекцию инфекционных агентов в окружающей среде.
Эпидемиология и инфекционный контроль. С помощью молекулярно-генетических методов определяют различия микроорганизмов одного вида (типируют микроорганизмы), выделенных от разных больных, в разных стационарах, в разных географических регионах. Это позволяет определять источники возбудителя, пути его распространения в стационаре, стране, мире и разрабатывать меры, контролирующие распространение эпидемических клонов.
Биотехнология, в том числе вакционология. С помощью молекулярно-генетических методов создают генетически модифицированные организмы с полезными для народного хозяйства свойствами. В последнее время в вакцинологии получил широкое распространение подход, называемый «обратной вакционологией». В классической вакцинологии основными объектами исследования являлись микроорганизмы-возбудители, которых инактивировали или лишали вирулентности, а затем микроорганизм или его компоненты использовали для вакцинации. В обратной вакцинологии основным объектом исследования является секвенированный геном микроорганизма, в котором с использованием компьютерного анализа проводят поиск генов (in silico анализ), кодирующих антигены микроорганизмов. Эти гены клонируют в геном E. coli или других неприхотливых микроорганизмов, которые начинают продуцировать «клонированные» белки, иммунногеные свойства которых изучают путем иммунизации мышей. Наиболее иммуногенные пептиды становятся кандидатами в вакцины и проходят дальнейшие клинические испытания. Такой подход использован для создания вакцин, в разработке которых с использованием классических методов испытывали сложности – против менингококков, стрептококков (Streptococcus pneumoniae), хламидий (Chlamydophila pneumoniae), стафилококков, иерсиний (Yersinia pestis), порфирормонад (Porphyromonas gingivalis), плазмодиев малярии (Plasmodium falciparum).
Систематика и эволюция микроорганизмов. Молекулярно-генетические методы позволяют создать естественную систематику микроорганизмов, отражающую их эволюционные взаимосвязи.
Геномика и патогеномика. При помощи молекулярно-генетических методов расшифровывают структуры и функций геномов, протеомов, внутриклеточных метаболитов, изучают молекулярный патогенез инфекционных заболеваний.
Материал для молекулярно-генетических исследований. Тип исследуемого материала зависит от симптомов, патогенеза, эпидемиологии предполагаемого заболевания. Для молекулярно-генетических исследований используется такой же материал, как и для бактериологического исследования:
– клинический биологический материал от больного (кровь, смывы, соскобы, слюна, гной, мокрота, спинномозговая жидкость, желудочный сок, отделяемое из уретры, моча, испражнения, биоптаты тканей и органов),
– пробы из объектов внешней среды (пищевые продукты, вода, почва),
– чистые культуры микроорганизмов.
Вид материала определяется методом, который будет использован для выделения ДНК/РНК.
Этапы молекулярно-генетических исследований.
1. Взятие материала, маркировка, транспортировка, подготовка проб к исследованию, хранение.
2. Экстракция ДНК/РНК.
3. Проведение молекулярно-генетических исследований.
4. Анализ и интерпретация результатов, выдача заключения.
Таблица 11