Характеристика стадий пцр

Стадия		Температура, 0С	Экспо-зиция	Описание стадии
Начальная денатурация		90–95	3–10 мин	Большие двухцепочечные молекулы ДНК раскручиваются с образованием одноцепочечных молекул.
25–40 циклов	денатурация	90–95	25с– 1 мин	Небольшие двухцепочечные ампликоны раскручиваются с образованием одноцепочечных молекул.
	отжиг	48–65i	25с– 4 мин	Праймеры прикрепляются к комплементарным фрагментам ДНК-матрицы, образуя дуплексы.
	элонгация	72	25с 4 мин	ДНК полимераза прикрепляется к 3’-концу праймера, соединившегося с ДНК-матрицей, и синтезирует копию, комплементарную ДНК-матрице.
Конечная элонгация		72	510 мин	Образуются дуплексы ДНК.
Хранение		4	-	-

Примечание. температура отжига зависит от нуклеотидного состава праймера и рассчитывается математически.

4

Рис. 34. Источник тока и камера для электрофореза

этап. Визуализация получаемых копий ДНК и регистрация результатов реакции. Образуемый высококонцентрированный раствор ампликонов ДНК прозрачен. Поэтому для выявления ДНК проводят электрофорез в агарозном геле, содержащем флюоресцирующий в УФ-свете ДНК-краситель  бромид этидия. ДНК движется в электрическом поле, взаимодействует с этидием бромидом и при просматривании в трансиллюминаторе (источник УФ света) выглядит в виде светящейся оранжевой полоски. Полученные результаты можно документировать, фотографируя электофореграммы с использованием оранжевого светофильтра.

Рис. 35. Камера для электрофореза с агарозным гелем

Проведение электрофореза (рис. 34, 35). Агарозный гель (0,5–4%) с лунками для образцов опускают в аппарат для проведения электрофореза, так чтобы лунки находились в области катода. В камеру для электрофореза заливают трис-ацетат-ЭДТА буфер так, чтобы толщина слоя жидкости над гелем составляла 12 мм. Образец смешивают с загрузочным красителем в соотношении 1:6 и вносят 6 – 20 мкл в лунку в геле. Обычно одновременно исследуют много образцов. Загрузочный краситель (зеленый, синий) имеет скорость движения, схожую с ДНК, поэтому по его перемещению судят о местонахождении ДНК в геле. В зависимости от плотности тока время проведения электрофореза составляет от 30 мин до 24 ч. После проведения электрофореза гель вынимают из камеры и переносят на столик трансиллюминатора, где бромистый этидий, связавшийся с ДНК, флюоресцирует в УФ-свете (230 нм), давая оранжевое свечение.

5 этап. Анализ и интерпретация результатов реакции (рис. 36). Для оценки результатов учитывают опытные лунки, а также лунки с положительным и отрицательным контролем (рис. 37, табл. 14).

Рис. 36. Автоматизированная система визуализация гелей –

трансиллюминатор, видеокамера, компьютер

Таблица 14

Анализ результатов ПЦР

Образцы	Светящиеся оранжевые полосы определенной молекулярной массы
Отрицательный контроль	должны отсутствовать
Положительный контроль	должны присутствовать
Опытные образцы положительные	присутствуют
Опытные образцы отрицательные	отсутствуют

1 2 3 4 5

Рис. 37. Электрофореграмма продуктов ПЦР при диагностике возбудителя бактериальной инфекции: 1- маркер молекулярного веса; 2 - положительный контроль; 3 – результат положительный; 4 - результат отрицательный; 5 – отрицательный контроль

Рис. 24. Электрофореграмма продуктов ПЦР при диагностике возбудителя бактериальной инфекции: 1-3 – результат положительный; 4, 5 – результат отрицательный; 6 – отрицательный контроль; 7

– положительный контроль.

При интерпретации результатов ПЦР следует помнить, что могут быть получены как ложноположительные, так и ложноотрицательные результаты.

Ложноположительные результаты могут наблюдаться в результате контаминации при нарушении правил проведения ПЦР. Ложноотрицательные результаты могут наблюдаться в результате снижения чувствительности ПЦР при ингибировании реакции компонентами биологических образцов.

Модификации ПЦР:

1. классическая (specific PCR) - амплификация участков ДНК размером до 5000 п.о. с использованием одной пары праймеров.

2. мультипраймерная (multiplex PCR) – одновременное использование нескольких пар праймеров в одной реакционной пробирке. Это позволяет проводить одновременную амплификацию ДНК различных возбудителей, что сокращает время и расход реактивов. Например, мПЦР для диагностики гнойных менингитов одновременно определяет ДНК наиболее вероятных возбудителей бактериальных менингитов: Neisseria meningitides, Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae.

3. широкодиапазонная  использование универсальных праймеров, взаимодействующих с высоко консервативными участками ДНК, встречающимися у многих микроорганизмов. Применяют для выявления в клиническом материале от больного микроорганизмов, в том числе неизвестных и некультивируемых. Обычно мишенью для ПЦР являются гены, кодирующие рибосомы 16S и 23S, имеющие сходную структуру у различных прокариот.

4. с обратной транскрипцией – используется для обнаружения РНК у РНК-вирусов. Первоначально при помощи РНК-зависимой ДНК-полимеразы (обратной транскриптазы или ревертазы) синтезируют комплементарную ДНК, которую затем используют в стандартной ПЦР.

5. гнездовая – обладает большей чувствительностью и специфичностью, т. к. проводится последовательно с двумя разными парами праймеров. ДНК продукты, образуемые в первой ПЦР, взаимодействуют со второй парой праймеров.

6. в реальном времени – используется для определения точечных мутаций, количественного содержания ДНК в пробе, а также для определения уровня экспрессии генов. Этот тип ПЦР находит все большее распространение, так как выявление ампликонов осуществляется по флюоресценции зондов либо красителя SybrGreen и не требует проведения электрофореза (сокращается время и трудоёмкость анализа).

7. ПП-ПЦР или ПЦР с использованием произвольных праймеров (RAPD-анализ полиморфизма случайно амплифицированной ДНК) – основана на использовании коротких праймеров, длиной 9–10 п. о., способных связаться с разными участками ДНК при низкой температуре отжига. В результате RAPD-анализа происходят амплификации нуклеотидных последовательностей в различных областях генома и образуются многочисленные фрагменты разной длины, по количеству и размерам которых судят о групповой или видовой принадлежности микроорганизма.

8. ассиимметричная – один из праймеров берут в концентрации в 10 раз большей, чем другой, чем добиваются преобладания среди продуктов реакции одноцепочечных ДНК над дуплексами.