Классификация молекулярно-генетических методов

Классификационный признак	Принципы методов
Методический подход	изучение фрагментов ДНК гибридизация нуклеиновых кислот амплификация нуклеиновых кислот анализ амплифицированных фрагментов определение последовательности нуклеотидов в ДНК, РНК и аминокислот в белках модификация генетической информации
Цель	идентификация микроорганизмов типирование микроорганизмов эволюционный и филогенетический анализ микроорганизмов определение положения и функций генов микроорганизмов изучение экспрессии генов

1. Методы, основанные на изучении фрагментов днк.

1. Плазмидное типирование (рис. 27, 28). При помощи специальных методов из бактерий выделяют плазмидную ДНК и проводят разделение плазмид в агарозном геле. Перед проведением электрофореза плазмидную ДНК можно обработать рестриктазами, что приводит к фрагментированию ДНК. Метод позволяет оценить количество плазмид, их размер, а также характер образуемых рестрикционных фрагментов. Плазмидный анализ широко используется в эпидемиологических исследованиях, особенно при расследовании вспышек заболеваний, вызванных такими микроорганизмами, как Staphylococcus spp., P. aeruginosa, представителями семейства Enterobactereaceae. Однако многие клинические штаммы способны терять плазмиды, особенно в процессе многочисленных пересевов в лаборатории.

1 2 3 4 5 6 7 8

Рис. 28. Установление идентичности Salmonella typhimurium, выделяемых от разных пациентов, по присутствию у них одинаковых плазмид (во время вспышки пищевого отравления от больных выделяли сальмонеллы с одинаковыми плазмидами размером 2900 п. о. (образцы 2, 3, 4, 7, 8)

1

1

2

3

3

4

4

4

4

5

6

7

8

8

8

8

9

Рис. 27. Рестрикционные профили плазмид, выделяемых у разных штаммов сальмонелл

(рестрикция с помощью эндонуклеазы BglII плазмиды bla_cmy-2 позволяет выявить 9 типов плазмид и распределить сальмонеллы на подтипы)

2. Рестрикционно эндонуклеазный анализ (REA). Бактериальную хромосому нарезают рестриктазами на множество фрагментов. Затем проводят электрофорез в пульсирующем электрическом поле, в результате которого фрагменты ДНК выстраиваются в зависимости от размера в шеренгу, образуя уникальный видоспецифический профиль (рис. 29).

Рис. 29. Рестрикционно эндонуклеазный анализ ДНК Staphylococcus spp.

По сходству рестрикционных профилей изучаемого и известных видов микроорганизмов можно идентифицировать и типировать микроорганизмы. Обычно для рестрикции используют макрорестриктазы – ферменты, распознающие участки, состоящие из 6 или более нуклеотидов (табл. 12). Такие участки распознавания присутствуют в геноме в небольшом количестве, поэтому в результате действия макрорестриктаз образуется до 30 достаточно крупных фрагментов. С помощью данного метода анализируется около 90% бактериальной хромосомы. С помощью компьютеризированной системы сканирования гелей могут быть созданы базы данных ретрикционных профилей для многих микроорганизмов.

Таблица 12

Примеры некоторых рестриктаз и их рестрикционных сайтов

Типы рестриктаз	Рестриктаза	Сайт распознавания
Макрорестриктазы, распознающие последовательности из 6 и более нуклеотидов	SmaI	5'...C C C^G G G...3' 3'...G G G^C C C...5'
	SalI	5'...G^T C G A C...3' 3'...C A G C T^G...5'
	XbaI	5'...T^C T A G A...3' 3'...A G A T C^T...5'
Стандартные рестриктазы	HaeIII (BsuRI)	5'...G G^C C...3' 3'...C C^G G...5'

Примечание. ^ - место рестрикции.