Признаки колоний микроорганизмов
Признаки колоний |
|||
размер (диаметр, мм) |
форма |
край |
поверхность |
точечные - до 1мм мелкие - 1-2мм средние - 2-4мм крупные - >4мм
|
правильная (круглая) неправильная (волокнистая, ризоидная, веретеновидная) |
ровный волнистый зубчатый лопастной складчатый |
матовая блестящая складчатая морщинистая
|
прозрачность |
консистенция (определяют, прикасаясь к колонии бакпетлёй) |
профиль |
цвет |
непрозрачные (стафилококки, бациллы) полупрозрачные (энтеробактерии, бактероиды) прозрачные как «капельки росы» (гонококки, вибрионы) |
вязкая, тянущаяся сухая, плотная
|
плоский высокий выпуклый подушечкообразный кратерообразный конусовидный пуповидный |
бесцветная окрашенная |
Способность бактерий образовывать на питательных средах окрашенные колонии определяется одним из двух факторов:
а) цветом пигмента, продуцируемого микроорганизмами. По химическому строению различают каратиноидные, меланиновые и другие пигменты, которые могут быть красного, оранжевого, жёлтого, коричневого, чёрного, синего или зелёного цвета. Пигментообразование детерминируется генетически. Пигменты обычно находятся в ЦПМ и защищают микробные клетки от эффектов фотоокисления, поэтому пигментообразование больше характерно для воздушной микрофлоры и служит фактором защиты от УФ. Чаще пигменты нерастворимы в питательных средах и окрашивают только колонии. Некоторые пигменты растворимы в воде (например, пиоцианин у псевдомонад) и потому диффундируют в среду, окрашивая её.
Примеры микроорганизмов, продуцирующих пигменты:
Staphylococcus aureus оранжево-желтый каротиноидный пигмент;
Pseudomonas aeruginosa – сине-зеленый пигмент пиоцианин (при нейтральной реакции - синий, при щелочной – зелёный);
Prevotella melaninogenica, Peptostreptococcus niger – коричнево-черный пигмент.
б) составом среды, на которой культивируют микроорганизмы. В состав селективных или дифференциально-диагностических сред могут входить:
– индикатор рН, цвет которого меняется при разложении углеводов в составе среды;
– красители, которые могут избирательно накапливаться в колониях ферментирующих углеводы микроорганизмов. Например, Escherichia coli разлагают лактозу и образуют на среде Эндо колонии малиново-красного цвета, а на среде Левина – фиолетового, колонии Salmonella spp. и Shigella spp., не разлагающих лактозу, на этих средах бесцветны или слабо-розовые.
– соли двухвалентных металлов, которые окрашивают колонии сероводородпродуцирующих микроорганизмов в серый или черный цвет (черные или серые колонии образуют сальмонеллы на висмут-сульфитном агаре, коринебактерий дифтерии на телуритовом агаре).
а б в
г д е
Рис. 19. Колонии микроорганизмов: а – микобактерий, б – бацилл сибирской язвы, в – нокардий, г – бактероидов, д – клостридий, е – бордетелл коклюша
Несмотря на множество признаков, которыми различаются колонии, большинство микроорганизмов образуют на средах один из четырех морфотипов колоний:
– гладкие, или S-колонии (от англ. smooth - гладкий) имеют ровные края, гладкую поверхность; они выпуклые, блестящие. S-формы микроорганизмов более вирулентны (исключая Y. pestis, B. anthracis). Такой вид колоний обусловлен присутствием в составе наружных оболочек микроорганизмов гидрофильных полисахаридов.
– шероховатые, или R-колонии (от англ. rough - шероховатый) имеют неровный край, исчерченную поверхность, они плоские, не блестят. R-формы микроорганизмов часто авирулентны. Такой вид колоний связан с гидрофобностью наружных оболочек бактерий из-за отсутствия в них гидрофильных полисахаридов.
– слизистые, или мукоидные, или М-колонии (от англ. mucus – слизистый) – у клебсиелл, имеющих выраженную полисахаридную макрокапсулу;
– карликовые, или D-колонии – у микоплазм и L-форм; видны только под малым увеличением микроскопа.
Под действием ряда факторов может происходить переход бактерий из S- в R-формы, называемый диссоциацией. Явление диссоциации у патогенных микробов наблюдается:
а) под действием химиопрепаратов;
б) под действием факторов иммунитета;
в) при попадании микроба во внешнюю среду.
При обилии в засеваемом материале микробов они растут в виде плёнки, покрывающей всю поверхность плотной питательной среды. Такой характер микробного роста получил название газонного. Посев газоном производят, когда нужно получить большие количества чистой микробной культуры (например, при определении чувствительности её к антибиотикам).
Стадии (фазы) роста бактериальной культуры на питательной среде (рис. 20).
Каждая фаза роста культуры в питательной среде характеризуется определённым размером клеток, скоростью размножения и потребления субстрата, синтезом метаболитов.
Логарифм количества жизнеспособных клеток
|
Время
Рис. 20. Фазы роста бактериальной культуры в питательной среде:
A – лаг-фаза;
B – период положительного ускорения;
C – лог-фаза;
D – фаза отрицательного ускорения;
E – стационарная фаза;
F – фаза отмирания.
A – фаза задержки роста (начальная стационарная), или лаг-фаза (от англ. lag – отставание), в среднем длится 1–2 ч. Начало лаг-фазы связано с адаптацией клеток к среде обитания. Важную роль играет «предыстория» выращивания посевной культуры. Если использован инокулят из культуры с резко отличающимися условиями выращивания, то клеткам требуется время на синтез новых рибосом, РНК и адаптивных ферментов. В этом периоде увеличивается размер клеток, в 8–12 раз повышается содержание РНК. Деления клеток при этом почти не происходит. Полноценная среда, физиологически активная посевная культура, которая подготовлена к синхронному делению, способствуют короткой лаг-фазе (или её отсутствию) и переходу ко II фазе. Синхронизации можно достичь с помощью пониженной температуры, ограничения питательных веществ, фильтрации, обеспечивающей пропускание клеток определенного размера. Синхронизация длится 2–4 генерации, а далее наступает асинхронный рост.
B – короткий период положительного ускорения между фазами A и B, когда начинается деление бактерии.
C – фаза логарифмического (экспоненциального) роста начинается, когда скорость роста клеток всей популяции достигает постоянной величины, средняя продолжительность её 5–6 ч. Скорость деления клеток максимальная, но клетки имеют наименьший размер. Популяция бактериальной культуры состоит из делящихся клеток и достаточно стандартна по своим свойствам (содержание белка, НК, наиболее выраженные видовые признаки), поэтому эта фаза удобна для определения многих параметров популяции (плотность бактерий, скорости роста и потребления субстрата, содержание биополимеров клетки). В этот период отмечено снижение резистентности к агрессивным веществам.
Несмотря на постоянную скорость роста популяции бактерий в логарифмической фазе, отдельные клетки все же находятся в разных стадиях деления. Иногда важно синхронизировать рост всех клеток популяции, то есть получить синхронную культуру. Простыми методами синхронизации являются изменение температурных условий или культивирование в условиях недостатка питательных веществ. Вначале культуру помещают в неоптимальные условия, затем сменяют их оптимальными. При этом у всех клеток популяции синхронизируется цикл деления, но синхронное деление клеток происходит обычно не более 3-4 циклов.
D – фаза замедления скорости роста (отрицательного ускорения) длится около 2 ч. Количество питательных веществ существенно уменьшается (отмечается воздействие на бактерии лимитирующих факторов), в культуральной жидкости накапливаются метаболиты, в том числе токсичные для бактерий (отмечается ингибирующее воздействие) и скорость деления клеток снижается.
E – стационарная фаза, или фаза максимальной концентрации (М-концентрация). Клетки перестают делиться. Однако, количество живых клеток постоянно, так как количество жизнеспособных бактерий соизмеримо с количеством отмирающих. В этот период клетки переходят на эндогенные субстраты (окисляют запасные вещества, белки, углеводы, липиды). Длительность стационарной фазы различается у разных микроорганизмов. Напр., у Escherichia coli она наступает через 18–24 ч, у Azotobacter – через 72 ч с момента внесения инокулята в питательную среду.
F – фаза отмирания, характеризуется массовой гибелью бактерий. В бактериальной популяции отмечается образование инволюционных форм, аутолиз под действием собственных ферментов. У бактерий меняются морфологические и биохимические свойства. Гибель может наступить через несколько дней, недель, месяцев.
В эту фазу различают периоды ускоренной гибели (количество живых клеток начинает снижаться с увеличивающейся скоростью), логарифмической гибели (количество живых клеток убывает с максимальной скоростью), уменьшения скорости гибели (количество живых клеток убывает с уменьшающейся скоростью) и стационарную фазу минимума (количество живых клеток минимально).
Управляемое культивирование микроорганизмов.
Промышленное использование микроорганизмов требует получения значительного количества микробного продукта (биомассы микроорганизмов, продуцируемых ими антибиотиков, токсинов и др.). Для этого используют методы управляемого культивирования микроорганизмов. Управляемое культивирование проводят в специальном оборудовании биореакторах, которые позволяют создавать благоприятные и равномерные условия для роста и размножения микроорганизмов, что повышает накопление их биомассы и метаболитов, сокращает время культивирования. Управляемое культивирование может быть периодическим или непрерывным, аэробным или анаэробным, поверхностным или глубинным (во всей толще жидкой питательной среды), защищенным (асептическим) или незащищенным.
Периодическое культивирование микроорганизмов – выращивание микроорганизмов в стационарных условиях (в питательной среде без непрерывного поступления нутриентов извне). В таких условиях по мере роста микроорганизмов происходит снижение количества белковых и углеводных субстратов, снижение окислительно-восстановительного потенциала и рН, что приводит к гибели культуры. Для периодического культивирования используют специальное оборудование ферментеры, в которых осуществляют постоянное перемешивание и аэрацию (барботаж) среды. Периодически ферментер опорожняют, производят выделение и очистку продукта, после чего начинают новый цикл. Существует несколько вариантов периодического культивирования:
продлённое периодическое культивирование, или культивирование с дробным дозированием субстрата подпитывают культуру периодически добавляя питательные вещества;
многоциклическое культивирование часть культуры предыдущего цикла переносят в новую среду;
отъемно-доливное культивирование в середине экспоненциальной фазы роста отбирают половину культуральной жидкости, а вместо неё вносят свежую питательную среду.
Непрерывное культивирование микроорганизмов выращивание микроорганизмов в динамических условиях (в постоянно обновляемой питательной среде). Проводят в специальных биореакторах хемостатах или турбистатах, которые снабжены устройствами для поддержания температуры и рН на постоянном уровне, а также для автоматической подачи свежей питательной среды и удаления культуральной жидкости с продуктами метаболизма. Микробная популяция тем самым поддерживается необходимое время в логарифмической фазе роста. Управление скоростью поступления питательных веществ в проточных биореакторах осуществляется двумя способами турбидостатным и хемостатным.
В турбидистате управление культивированием проводят путем измерения мутности выходящего потока с использованием фотоэлектрического элемента. Скорость разбавления свежей средой устанавливают в зависимости от требуемой плотности выходящей из турбидистата культуры.
В хемостатах управление культивированием проводят путем лимитирования концентрации одного из ростовых факторов в поступающей в хемостат среде (например, концентрацию глюкозы, фосфора, серы), тем самым изменяют плотность микробных клеток в единице объёма среды.