Питання до семінарського заняття:

1. Суть явища каталізу.

2. Швидкість хімічних реакцій.

3. Особливості ферментативного каталізу.

4. Механізм дії ферментів.

5. Властивості ферментів.

6. Вплив різних чинників середовища на ферментативні процеси.

7. Вплив інгібіторів на ферментативну активність.

8. Класифікація і номенклатура ферментів.

9. Коферменти, простетичні групи.

10. Роль вітамінів, металів і інших кофакторів у функціонуванні ферментів.

11. Основні уявлення про кінетику ферментативних процесів, залежність швидкості ферментативної реакції від концентрації субстрату. Рівняння Міхаеліса-Ментен.

12. Ізоферменти й інші різновиди ферментів.

13. Одиниці активності ферментів.

14. Локалізація ферментів у клітині.

15. Загальна характеристика вітамінів. Класифікація.

16. Вітаміни - попередники коферментів.

17. Характеристика жиророзчинних (А, Д, Є, К) і водорозчинних (В₁, В₂, В₃, РР, В₆, В₁₂, В₁₅, Н, С, Р) вітамінів по такій схемі:

    1. Назва.

    2. Формула. Характеристика фізичних і хімічних властивостей по формулі.

    3. Джерела вітаміну.

    4. Вплив на організм. Роль в обміні речовин.

    5. Авітаміноз, гіповітаміноз, гіпервітаміноз.

18. Рішення задач.

Заняття № 11.

Тема: ВИЗНАЧЕННЯ КОНЦЕНТРАЦІЇ ГЛЮКОЗИ В КРОВІ за КОЛЬОРОВою РЕАКЦІєю З ортотолуІдином

Теоретична частина:

В основному вуглеводи виконують енергетичну функцію. Головними джерелами енергії є глюкоза та глікоген. До того ж, із вуглеводів можуть синтезуватися ліпіди, деякі амінокислоти, пентози.

Добова норма вуглеводів у їжі складає 400-500 г. Основними вуглеводами їжі є: крохмаль та дисахариди - сахароза, лактоза, мальтоза.

Гідроліз крохмалю починається в порожнині рота за участю ферменту амілази слини до декстринів. Потім його гідроліз продовжується у верхньому відділі кишечника під впливом панкреатичної амілази. У результаті з крохмалю утворюються дисахаридні залишки мальтози. Гідроліз всіх дисахаридів здійснюється на поверхні клітин кишечнику та каталізується специфічними ферментами: сахаразою, лактазою, мальтазою, які синтезуються в клітинах кишечника.

З кров’ю воротньої вени більша частина глюкози із кишечника надходить до печінки, решта глюкози через загальний кровообіг транспортується в інші тканини. Концентрація глюкози в крові у нормі піддержується на постійному рівні та складає 3,33-5,55 мкмоль/л, що відповідає 80-100 мг в 100 мл крові. Транспорт глюкози в клітини носить характер полегшеної дифузії, але регулюється в багатьох клітинах гормоном підшлункової залози – інсуліном.

В організмі вуглеводи можуть підлягати окисненню або використовуватися для синтезу глікогену – резервного вуглеводу тканин (печінки, м'язів, нервової тканини та ін.). Головним депо вуглеводів є печінка.

Вивчення енергетики м'язової діяльності показало, що при роботі м'язів відбувається розпад вуглеводів і утворення продуктів їх окиснення. Особливо велика роль вуглеводів як джерела енергії в умовах недостатнього постачання тканинам кисню (гіпоксія) і при м'язовій діяльності великої інтенсивності, коли різко зростає потреба організму в кисні, яка не може бути повністю задоволена.

Окиснення вуглеводів відбувається в 2 стадії. Перша стадія називається гліколізом. Вона полягає в неповному окисненні глюкози до двох молекул піровиноградної кислоти (аеробний гліколіз) або двох молекул молочної кислоти (анаеробний гліколіз). Всі десять реакцій гліколізу протікають у цитозолі та характерні для всіх органів та тканин. Друга стадія має назву окислювального циклу трикарбонових кислот (або циклу Кребса). Вона полягає в аеробному окисненні залишків піровиноградної кислоти (у виді ацетильних радикалів) до кінцевих продуктів окиснення – вуглекислоти і води.

Обидва процеси – і гліколіз, і цикл Кребса – складаються із багатьох проміжних реакцій. Унаслідок цього енергія, яка заключена у вуглеводах, звільняється поступово, перетворюючись у багаті енергією фосфорні сполуки - у кінцевому рахунку в аденозинтрифосфорну кислоту (АТФ).

Біохімічні перетворення глюкози починаються з утворення гексозофосфорних ефірів. Наступні перетворення цих ефірів під дією відповідних ферментів приводять до утворення з кожного глюкозного залишку двох молекул фосфогліцеринового альдегіду, який потім окиснюється. У результаті цієї реакції утворюється відновлений НАД(НАДН) і 1,3-дифосфогліцеринова кислота (або 3-фосфогліцероїлфосфат), змішаний ангідрид фосфорної і 3-фосфогліцеринової кислоти, в якому акумулюється енергія окиснювання гліцеральдегид-3-фосфату. Ангідрид такого типу називається ацилфосфатом і характеризується дуже високим значенням G°` гідролізу (-11,8 ккал/моль), тобто відноситься до категорії понадвисокоенергетичних фосфорильованих сполук (макроергічних сполук). Багатий енергією фосфорильний залишок (з 1 положення 1,3-дифосфогліцеринової кислоти) потім переноситься на АДФ із утворенням АТФ.

Другим етапом гліколізу, на якому відбувається синтез АТФ, є перетворення фосфоенолпіровиноградної кислоти у піровиноградну. Таким чином, у процесі гліколізу синтезуються десять молекул АТФ на одну молекулу глюкози. Із цих десяти молекул АТФ одна використається при утворенні глюкозо-6-фосфата, а інша - при утворенні фруктозо-1,6-дифосфата. У підсумку залишаються вісім молекул АТФ.

В умовах неповного задоволення потреби організму в кисні піровиноградна кислота приєднує водень від відновленої форми НАД, перетворюючись у молочну кислоту:

СН₃ СН₃

│ │

2 С ═ О + 2 над∙ Н₂ 2 СН ─ ОН + 2 НАД⁺

│ │

СООН СООН

піровиноградна молочна

кислота кислота

У результаті утворюється тільки дві молекули АТФ.

Анаеробний розпад вуглеводів у деяких мікроорганізмів, наприклад, процес спиртового шумування в дріжджових клітинах подібний із процесом гліколізу у тваринних тканинах. Розходження має місце на кінцевих етапах розпаду вуглеводів. При спиртовому шумуванні відбувається декарбоксилування піровиноградної кислоти з утворенням оцтового альдегіду, який і служить акцептором водню з НАД Н⁺. Кінцевими продуктами спиртового шумування є етиловий спирт і вуглекислий газ.

Процес анаеробного розпаду вуглеводів може починатися не із глюкози (гліколіз), а із глікогену (глікогеноліз). Фермент глікогенфосфорилаза каталізує фосфоролітичне розщеплення α-I,4-глікозидного зв'язку в глікогені з боку термінального не редукованого залишку глюкози з утворенням глюкозо-1-фосфату. Дія глікогенфосфорилази на глікоген припиняється в крапках розгалуження до тих пір, доки не відбудеться розщеплення α-1,6-глюкозидних зв'язків, яке каталізується ферментом аміло-1,6-глюкозидазою.

У підручниках з біохімії дається опис складної системи регуляції активності глікогенфосфорилази і переходу неактивної форми фосфорилази (фосфорилази Б) в активну форму (фосфорилазу А) шляхом фосфорилювання (ковалентна модифікація серинових залишків у молекулі фосфорилази Б), а також шляхом зворотнього переходу димерної фосфорилази в тетрамерну. У регуляції беруть участь гормони, циклічна АМФ, іони Ca²⁺, АТФ, АМФ, глюкозо-6-фосфат і глюкоза. Активація глікогенфосфорилази може приводити до прискорення розщеплення глікогену в кілька сотень і навіть тисяч разів. Глюкозо-1-фосфат, який утворюється під дією фосфорилази, перетворюється при участі фосфоглюкомутази в глюкозо-6-фосфат, який включається в процес гліколізу. Перетворення одного глюкозного залишку глікогену в молочну кислоту супроводжується синтезом чотирьох молекул АТФ також, як і при гліколізі. Але сумарний вихід становить три молекули АТФ, тому що одна молекула АТФ використовується для фосфорилювання фруктозо-6-фосфату.

Розгляд регуляції процесу гліколізу варто почати з фосфофруктокінази - головного ключового ферменту, який визначає сумарну швидкість гліколізу. Фосфофруктокіназа - алостеричний фермент, активність якого залежить від цілого ряду факторів, головним чином від співвідношення між АТФ, АДФ і неорганічним фосфатом. Один з можливих механізмів ефекту Пастера (пригнічення гліколізу подихом) полягає, очевидно, у тім, що високе співвідношення в клітині [АТФ]/[АДФ], характерне для дихального фосфорилювання, приводить до інгібірування фосфофруктокінази і, відповідно, до зниження швидкості гліколізу. У цих умовах накопичується глюкозо-6-фосфат - інгібітор іншого регуляторного ферменту - гексокінази.

Інший механізм пригнічення гліколізу подихом заснований на конкуренції за АДФ між дихальним фосфорилюванням і такими ферментами гліколізу, як фосфогліцераткіназа і піруваткіназа. Можлива конкуренція між дихальним фосфорилюванням і гліколізом за неорганічний фосфат. Якщо через недолік неорганічного фосфату не відбудеться реакція гліколітичної оксидоредукції, яка сполучена з фосфорилюванням, то диоксиацетонфосфат може відновлюватися в гліцерофосфат - попередник ліпідів.

Піровиноградна кислота є проміжним продуктом гліколізу і глікогенолізу. В умовах достатнього постачання тканин киснем (аеробні умови) молочна кислота із неї, як правило, не утворюється. Виключення становлять лише деякі нормальні тканини, які слабко забезпечуються кров'ю, наприклад, кришталик і роговиця ока, і злоякісні пухлини тварин. У білих м'язах риб і домашніх птахів аеробний метаболізм також відносно невеликий, і основним кінцевим продуктом гліколізу є молочна кислота. В умовах великого фізичного навантаження в м'язах виснажуються запаси кисню і накопичується молочна кислота. Незначна частина молочної кислоти надходить у кров і переноситься в печінку, де вона знову окисляється в піровиноградну кислоту, яка у процесі глюконеогенезу перетворюється в глюкозу або глікоген. Глюкоза з токовищем крові вертається в м'язи, де з неї синтезується глікоген. Цикл глюкози й молочної кислоти має назву циклу Корі. Однак у м'язах тварин і людини він здійснюється лише в дуже обмежених масштабах. Установлено, що в стані спокою в м'язах відбувається перетворення молочної кислоти в глікоген. Цикл Корі має значення для тих тканин, де відбувається анаеробний обмін.

Глюконеогенезом називають синтез глюкози і глікогену із сполук невуглеводної природи. Основними субстратами глюконеогенезу служать лактат, гліцерин і амінокислоти. Лактат під дією лактатдегідрогенази перетворюється в піруват, з якого утворюється фосфоенолпіруват. Включення в глюконеогенез гліцерину, який утворюється при розпаді жирів, відбувається через його фосфорилювання і наступне перетворення в гліцерофосфат і далі в гліцеральдегід-3-фосфат і диоксиацетонфосфат. Всі амінокислоти, за винятком лейцину, можуть служити попередниками фосфоенолпіровиноградної кислоти, а отже глюкози і глікогену. Головними попередниками пірувату і фосфоенолпірувату є проміжні продукти циклу трикарбонових кислот (циклу Кребса).

Більшість реакцій глюконеогенезу - це зворотні реакції гліколізу. Однак три реакції гліколізу практично незворотні: піруваткіназна, фосфофруктокіназна і гексокіназна. Обхід піруваткіназної реакції відбувається у два етапи. Спочатку піровиноградна кислота карбоксилюєтся в щавлево-оцтову кислоту (оксалоацетат). Реакція каталізується піруваткарбоксилазаю і супроводжується гідролізом АТФ. В активному центрі ферменту перебуває міцно приєднаний ковалентним зв'язком біотин (вітамін Н). Для активації піруваткарбоксилази тваринних тканин необхідний ацетил-КоА.

1. Пируват + СаО₂ + АТФ+Н₂О Оксалоацетат + АДФ + Р_неорг

Потім оксалоацетат під дією фосфоенолпіруваткарбоксикінази декарбоксилюється і фосфорилюється за рахунок ГТФ (гуанозинтрифосфату) або ІТФ (інозинтрифосфату) з утворенням фосфоенолпірувату.

2. Оксалоацетат + ГТФ фосфоенолпіруват + З0₂ + ГДФ

Обхід наступних двох реакцій гліколізу досягається шляхом гідролітичного розщеплення фосфорноефірних зв'язків у фруктозо-1,6-дифосфаті і в глюкозо-6-фосфаті під дією специфічних фосфатаз (фруктозодифосфатази і глюкозо-6-фосфатази відповідно). У результаті цих реакцій утворюється неорганічний фосфат, фруктозо-6-фосфат і глюкоза:

Фруктозо-1,6-дифосфат + H₂О Фруктозо-6-фосфат + Р_неорг,

Глюкозо-6-фосфат + H₂О Глюкоза + Р_неорг.

Рівняння сумарного процесу глюконеогенезу:

2Лактат + 6АТФ Глюкоза + 6АДФ+ 6Р_неорг.

АТФ споживається в реакціях, які каталізуються піруваткарбоксилазою, фосфоенополпіруваткарбоксиназою і фосфогліцераткіназою.

Глюкозо-6-фосфатаза активна в печінці. Глюкоза, яка утворюється із глюкозо-6-фосфату, надходить із печінки в кров і доставляється в інші тканини. Один з механізмів регуляції вмісту глюкози в крові реалізується через інгібірування глюкозо-6-фосфатази продуктом реакції - глюкозою.

У м'язах глюкозо-6-фосфатаза не виявлена. У них відбувається перетворення глюкозо-6-фосфату під дією фосфоглюкомутази в глюкозо-1-фосфат і далі в уридиндифосфатглюкозу, яка служить субстратом для глікогенсинтази:

УДФ глюкоза + (І,4-а-D-глюкозил)_n УДФ+(1,4- а-D-глюкозил)_n+1.

Уридинтрифосфат (УТФ) регенерується за рахунок АТФ:

УДФ + АТФ УТФ + AДФ.

У регуляції активності глікогенсинтази і глікогенфосфорилази в печінці й м'язах бере участь ряд гормонів - адреналін , глюкагон, інсулін, гідрокортизон - і ряд метаболітів.

Звертає на себе увагу центральна роль глюкозо-6-фосфату в обміні вуглеводів. Він утворюється із глюкози або глікогену, і подальші його перетворення можуть протікати за чотирма різними метаболічними шляхами:

1. Шляхом синтезу глікогену через перетворення в глюкозо-1-фосфат;

2. Шляхом гліколізу через перетворення у фруктозо-6-фосфат;

3. Гідроліз до глюкози і фосфорної кислоти під дією глюкозо-6-фосфатази;

4. За пентозофосфатним шляхи через окиснювання в 6-фосфоглюконову кислоту.

Далі варто перейти до розгляду пентозофосфатного шляху перетворення вуглеводів (його також називають фосфоглюконатним шляхом, або гексозомонофосфатним циклом, або пентозним циклом). Для ряду тваринних і рослинних тканин і деяких мікроорганізмів доведена можливість прямого окиснювання глюкозо-6-фосфата з відщіпленням вуглекислого газу й утворенням рибулозо-5-фосфату, який ізомеризується в рибозо-5-фосфат :

1. Глюкозо-6-фосфат 6-фосфоглюконолактон.

НАДФ⁺ НАДФ Н⁺

2. 6-фосфоглюконолактон + H₂O 6-фосфоглюконова кислота.

3. 6-фосфоглюконова кислота Рибулозо-5-фосфат + СО₂

НАДФ⁺ НАДФ Н⁺

На цьому закінчується окисний етап пентозофосфатного шляху перетворення вуглеводів. Наступні реакції пентозофосфатного шляху відносяться до неокиснювального етапу:

4. Перетворення однієї молекули рибулозо-5-фосфату в рибозо-5-фосфат під впливом ізомерази і перетворення іншої молекули рибулозо-5-фосфата в ксилулозо-5-фосфат, яке каталізується епімиразою.

5. Перша транскетолазна реакція – перенос глікольальдегідної групи від ксилулозо-5-фосфату на рибозо-5-фосфат. Утворюється гліцеральдегид-3-фосфат і седогептулозо-7-фосфат. Коферментом транскетолази служить тіамінпірофосфат - фосфорильоване похідне вітаміну B₁.

6. Фермент трансальдолаза каталізує перенос диоксиацетонової групи від седогептулозо-7-фосфата на гліцеральдегід-3-фосфат з утворенням еритрозо-4-фосфату і фруктозо-6-фосфату відповідно.

7. Друга транскетолазна реакція - перенос глікольальдегідної групи від ксилулозо-5-фосфату на еритрозо-4-фосфат. У результаті цієї реакції утворюється гліцеральдегід-3-фосфат і фруктозо-6-фосфат. На цій стадії пентозофосфатний шлях може перейти в гліколітичний. Перетинання метаболічних шляхів може відбутися й раніше на рівні утворення фруктозо-6-фосфату в трансальдолазній реакції й на рівні першої транскетолазної реакції, коли утворюється гліцеральдегід-3-фосфат - загальний проміжний продукт пентозофосфатного шляху перетворення вуглеводів і гліколізу.

Можливе і повне окиснення глюкозо-6-фосфату ферментами пентозофосфатного шляху: з 6 молекул глюкозо-6-фосфату утворюється 6 молекул рибулозо-5-фосфату і 6 молекул СО₂. Потім 6 молекул рибулозо-5-фосфату через ряд проміжних реакцій знову перетворюються в 5 молекул глюкозо-6-фосфату. Рівняння сумарної реакції:

6Глюкозо-6-фосфат + 12НАДФ⁺ 5 Глюкозо-6-фосфат + 6СО₂ +

12 НАДФ + 12Н⁺ + Р_неорг.

У підсумку одна молекула глюкозо-6-фосфата повністю окислюється до вуглекислого газу, води і неорганічного фосфату.

Значення пентозофосфатного шляху складається, по-перше, у тім, що утворюються важливі метаболіти, у тому числі рибозо-5-фосфат, необхідний для синтезу нуклеїнових кислот. По-друге, утворюється відновлений НАДФН, використовуваний для процесів біосинтезу жирних кислот, холестерину, стероїдних гормонів і для інших відбудовних процесів. Пентозофосфатний шлях особливо важливий для тих органів і тканин, у яких ці синтези йдуть найбільше активно - для печінки, молочної залози, жирової тканини, кори наднирників, еритроцитів, лімфатичних вузлів і для деяких інших тканин.

У хлоропластах рослин і в деяких бактерій пентозофосфатний шлях функціонує у зворотньому напрямку – відновлюючий пентозофосфатний шлях, відомий за назвою циклу Кальвіна, який складається з реакцій пентозофосфатного і гліколітичного шляхів. Реакції пентозофосфатного шляху є ключовими в процесі фотосинтезу, які приводять до утворення цукрів.

Піровиноградна кислота - проміжний продукт гліколізу і обміну деяких амінокислот, а також гліцерину, який входить до складу жирів, у аеробних умовах окислюється до вуглекислого газу і води. Процес починається з окисного декарбоксилювання піровиноградної кислоти. Реакція каталізується піруватдегидрогеназою - мультиферментним комплексом з молекулярною вагою порядком декількох мільйонів і локалізованим у мітохондріях. До складу комплексу входять три ферменти - піруват декарбоксилаза, ліпоїлтрансацетилаза, ліпоїлгідрогеназа і п'ять коферментів (тіамінпірофосфат, ліпоєва кислота, коензим А, ФАД і НАД).

У результаті послідовно протікаючих реакцій, з піровиноградної кислоти утворюються вуглекислий газ і ацетил-КоА, який конденсується із щавлево-оцтовою кислотою й вступає в цикл трикарбонових кислот (цикл Кребсу, лимоннокислий цикл). При одному обороті циклу відбувається повне окиснення однієї ацетильної групи до вуглекислого газу і води.

Використання проміжних продуктів циклу трикарбонових кислот для біосинтезів поповнюється за рахунок анаплеротичних (які відшкодовують, або наповнюють) реакцій. Такою реакцією, найбільш важливої для клітин печінки і нирок, є піруваткарбоксилазна реакція. Піруваткарбоксилаза каталізує карбоксилювання пірувату з утворенням оксалоацетату. Роль потужного алостеричного активатора піруваткарбоксилази грає ацетил-КоА. У його відсутність фермент практично неактивний.

У м'язовій тканині й серці анаплеротичними реакціями служать дві зворотні реакції, які каталізуються фосфоенолпіруваткарбоксилазою (1) і малат-ферментом (2):

1. Фосфоенолпіруват + СО₂ + ИДФ Оксалоацетат + ИТФ.

2. Малат + НАДФ⁺ Піруват + СО₂ + НАДФН • Н⁺.

Оксалоацетат, який утворюється в анаплеротичних реакціях використовується в циклі трикарбонових кислот, у глюконеогенезі і в утворенні аспарагінової кислоти. З іншого боку, надлишок оксалоацетату в мітохондріях діє як конкурентний інгібітор сукцинатдегідрогенази. Відбувається блокування циклу трикарбонових кислот на етапі окиснення бурштинової кислоти доти, доки приток додаткової кількості ацетил-КоА не приведе до видалення надлишку оксалоацетату в цитратсинтазній реакції.

Цикл трикарбонових кислот займає ключове положення в обміні речовин. Швидкість циклу лімітується активністю ізоцитратдегідрогенази - алостеричного ферменту, специфічним активатором якого служить АДФ, а інгібіторами - АТФ і НАДН.

До регуляторних ферментів циклу трикарбонових кислот відноситься і цитратсинтаза - алостеричний фермент, каталізуючий першу реакцію циклу (конденсації ацетил-КоА із щавлево-оцтовою кислотою). Цей фермент також інгібується кінцевими продуктами циклу - АТФ і НАДН. Інгібірування знімається АДФ і АМФ. Накопичення в мітохондріях цитрату і вихід його в цитоплазму приводить до інгібірування початкових стадій гліколізу (інгібірування фосфофруктокінази) і до прискорення синтезу жирних кислот шляхом активації ацетил-КоА-карбоксилази. Ізоцитрат поряд із цитратом активує ацетил-КоА-карбоксилазу. Надлишок цитрату в цитоплазмі розпадається під дією цитратліази з утворенням оксалоацетату і ацетил-КоА. Останній використовується для синтезу жирних кислот.

Можливі і інші різноманітні механізми регуляції циклу трикарбонових кислот відповідно до енергетичних і біосинтетичних потреб клітини. Складна система регуляції циклу трикарбонових кислот забезпечує необхідний у нормальних умовах баланс надходження і споживання проміжних продуктів циклу, щоб не було ні надлишку, ні недоліку в них. При деяких станах, наприклад, при голодуванні, баланс порушується, тому що в результаті посиленого розпаду жирів у тканинах накопичується ацетил-КоА, з'являється надлишок ацетоацетату й інших "кетонових тіл". Це веде до виникнення патологічного стану, який має назву кетоз. Надмірне зниження змісту вуглеводів у їжі й патологічні порушення вуглеводного обміну (діабет) також приводять до кетозу.

Найбільш важливим для розуміння питань біоенергетики є наступне положення. При окисних перетвореннях окремих членів циклу трикарбонових кислот (ізолімонної, а-кетоглутарової, бурштинової й яблучної кислот) звільняється лише незначна кількість енергії, причому в фосфорильних залишках АТФ вона акумулюється тільки при окисному декарбоксилюванні а-кетоглутарової кислоти. Окиснення ж інших субстратів не супроводжується синтезом АТФ і звільненням помітної кількості енергії. Основна маса енергії звільняється при транспорті протонів і електронів від субстратів, які окислюються, на молекулярний кисень (при тканьовому подиху). Тому, перш ніж закінчити розгляд обміну вуглеводів, рекомендуємо розібратися в сучасній теорії тканьового подиху, викладеного в підручниках.