Ферменты репликации

Как уже отмечалось, принцип комплементарности, заложенный в структуре двойной спирали ДНК, определяет возможность самокопирования генетического материала. Как и большинство других биологических процессов, репликация ДНК обеспечивается координированной работой ряда ферментов. Важнейшие из них: ДНК-топоизомеразы, обеспечивающие локальное расплетание ДНК, необходимое для инициации ее репликации и образование одиночных цепей, служащих матрицами для вновь синтезируемых дочерних молекул. Расплетенная замкнутая кольцевая молекула под действием фермента ДНК-гиразы образует сверхскрученную форму с большим запасом свободной энергии, расходуемой затем в ходе репликации; ДНК-полимеразы, катализирующие добавление нуклеотидов к 3ОН концу цепи ДНК; ДНК-лигазы, сшивающие сахарофосфатный конец молекулы.

Изучение ферментологии репликации ДНК было начато А. Корнбергом (1957), выделившим из E.coli ДНК-полимеразу I. Этот крупный фермент с М_r 109 000 способен осуществлять синтез ДНК in vitro, катализируя ковалентное присоединение к предсуществующей цепи ДНК 5-нуклеотидов, предшественниками которых служат содержащиеся в клетках трифосфаты дезоксиаденозина (дАТФ), дезокситимидина (ТТФ), дезоксигуанозина (дГТФ) и дезоксицитидина (дЦТФ). ДНК-полимераза не способна начать синтез цепей ДНК de novo, поэтому для проявления ее полимеризующей активности необходимо, чтобы в системе присутствовала так называемая ДНК-затравка, т.е. цепь ДНК, имеющая свободный 3ОН конец. ДНК-полимераза I обеспечивает образование фосфодиэфирной связи между 3ОН концом ДНК-затравки и 5-фосфатом присоединяемого дезоксирибонуклеотида с одновременным освобождением пирофосфата, т.е. двух остатков фосфорной кислоты. В результате ДНК-затравка удлиняется в направлении от своего 5-фосфатного конца к 3-гидроксильному. Присутствие в этой системе еще одной одноцепочечной ДНК, так называемой ДНК-матрицы, определяет, какие именно дезоксирибонуклеотиды должны присоединяться к ДНК-затравке. Таким образом, в присутствии ДНК-затравки и ДНК-матрицы ДНК-полимераза I обеспечивает синтез дочерней цепи ДНК, комплементарной одной из цепей родительской ДНК, что, является необходимым элементом полуконсервативной репликации. Вместе с тем ДНК-полимераза I - многофункциональный фермент. Помимо 5-3-полимеразной активности она обладает еще 3-5-экзонуклеазной активностью, катализирующей отщепление нуклеотидов с 3-конца синтезирующейся полинуклеотидной цепи. Эта активность получила название “корректорной”, поскольку направлена на коррекцию (исправление), хотя и очень редких ошибок полимеразной активности, в результате которых в растущую цепь подстраивается ошибочный нуклеотид, не комплементарный противоположному нуклеотиду ДНК-матрицы. “Корректорная” активность ДНК-полимеразы I обеспечивает точность репликации ДНК и тем самым снижает частоту мутаций, связанных с ее ошибками. Обе активности располагаются в одном активном центре молекулы ДНК-полимеразы I, что как бы создает возможность “слежения” 3-5-экзонуклеазной за точностью работы 5-3-полимеразной. Наряду с этим ДНК-полимераза I имеет еще один активный центр, в котором находится 5-3-экзонуклеазная активность, участвующая, возможно, в репарации повреждений ДНК.

Более поздние исследования показали, что ДНК-полимераза I играет в вегетативной репликации хромосом у E.coli не основную, а лишь вспомогательную роль. Изучение мутантов E.coli, дефектных по полимеразной активности этого фермента, выявило их способность к репликации ДНК. Однако такие мутанты оказались высокочувствительными к летальному действию УФ-излучения, что указывало на их неспособность к репарации поврежденной ДНК. Отсюда был сделан вывод, что ДНК-полимераза I обеспечивает in vivo не вегетативный, а репаративный синтез ДНК, направленный на восстановление ее нормальной структуры после вырезания поврежденных физическими или химическими воздействиями участков. Вместе с тем в клетках E.coli были обнаружены еще две ДНК-полимеразы (II и III), одна из которых, ДНК-полимераза III (М_r свыше 250 000), играет основную роль в вегетативной репликации ДНК.

Большинству обнаруженных у прокариот ДНК-полимераз присущи две из трех рассмотренных функций ДНК-полимеразы I: способность катализировать рост цепей ДНК в 5-3-направлении путем подстановки 5-нуклеотидов, комплементарных ДНК-матрице, и коррекция возможных ошибок в ходе этого процесса с помощью 3-5-экзонуклеазной активности. У различных эукариот в настоящее время выявлены, по крайней мере, три ДНК-полимеразы: , , . Предполагается, что первая играет основную роль в репликации ядерной ДНК, а вторая - в ее репаративном синтезе. Роль третьей до конца не выяснена.