Мутагены, действующие на покоящуюся и реплицирующуюся днк

Алкилирующие агенты. Известны 9 классов алкилирующих агентов, различающихся по типу алкильных групп (СН₃-метильной, С₂Н₅-этильной и более сложных), которые они переносят на биологически важные макромолекулы, включая ДНК, и по числу алкильных групп, которые может отдавать одна молекула алкилирующего агента. Последнее свойство характеризует функциональность соединения, причем “полифункциональными” называют все алкилирующие агенты, у которых число алкильных групп больше единицы. Степень функциональности определяется особенностями соединения, а не только числом алкильных групп. Так, несущий две метильные группы метилметансульфонат СН₃ОSOСН₃, способен отдавать только одну из них, поэтому относится к монофункциональным.

Механизм мутагенного и летального действия многих алкилирующих агентов не вполне ясен. Известно, однако, что при действии соединений из группы нитрозоалкиламинов (нитрозонитроалкилгуанидина, алкилнитрозомочевины) основным предмутационным изменением в ДНК является образование О⁶-алкилгуанина, а гибель клеток вызывается преимущественно образованием 3-алкиладенина и 3-алкилгуанина. Вместе с тем наиболее часто алкилированию подвергается атом азота в 7-ом положении гуанина. Например, 98% всех повреждений ДНК, индуцированных метилметансульфонатом, составляют метилированные основания, среди которых на долю N⁷-мелтилгуанина приходится 84%. Тем не менее мутагенный эффект этого алкилирующего агента непосредственно не связан с присутствием в ДНК модифицированных оснований, а обусловлен индукцией системы ошибающейся репарации ДНК.

Главное следствие мутагенного действия алкилирующих агентов - появление мутаций типа транзиций ГЦАТ. Кроме того, в результате ошибок репарации могут возникать мутации типа транзиций АТГЦ, трансверсий и сдвига рамки считывания. Некоторые, особенно бифункциональные алкилирующие агенты, например азотистый иприт или антибиотик митомицин С, вызывают поперечные сшивки цепей молекул ДНК, приводящие к разрывам хромосом и, как следствие, к хромосомным аберрациям.

Мутагенное действие некоторых нитрозосоединений (диэтилнитрозомочевины, нитрозометил- и нитрозоэтилмочевины и др.) столь значительно, что общая частота вызываемых ими мутаций может достигать 100%. Из этих соединений часто используется N-метил-N^/-нитро-N-нитрозогуанидин (сокращенно нитрозогуанидин), способный индуцировать мутации в участках хромосомы E. coli, которые в момент обработки мутагеном находятся в репликативной вилке. На дрозофиле же этот мутаген вызывает генные мутации и перестройки в сперматозоидах, в которых репликации ДНК не происходит. Нитрозоалкилмочевины нашли широкое применение в селекции растений.

В механизме разрывов цепи ДНК под действием алкилирующих агентов важная роль принадлежит процессу возникновения “апуриновых брешей”, возникающих вследствие ослабления связей между алкилированным гуанином либо (реже) аденином и сахарофосфатным остовом, ведущего к постепенному выпадению пурина из алкилированной ДНК. На место выпавшего пурина в образовавшийся апуриновый сайт может встроиться какое-либо другое основание, что ведет к возникновению генной мутации.

Отмечено сходство генетических эффектов между алкилирующими агентами и рентгеновскими лучами. Поэтому иприт и близкие к нему соединения иногда называют “радиомиметиками” (от греч. “mimetes”-подражатель). Действительно, многие алкилирующие агенты, как и рентгеновские лучи, вызывают доминантные, сцепленные с полом летали и видимые мутации, крупные и мелкие делеции, инверсии и транслокации. Подобно рентгеновским лучам, химические радиомиметики способны индуцировать кроссинговер в соматических и половых клетках.

Доказательства существования замедленного мутагенеза и нестабильности, связанных с действием алкилирующих агентов, были получены при анализе мозаичных мутантов у дрозофилы и дрожжей. У таких мутантов часть клеток является мутантной по определенному признаку, а другая часть сохраняет по тому же признаку дикий фенотип. Способность вызывать мозаичные мутации присуща всем мутагенам, как физическим, так и химическим. Образование мозаик непосредственно связано с молекулярным механизмом индуцированного мутагенеза. Известно, что в каждом данном сайте предмутационные изменения затрагивают одну или обе цепи дуплекса ДНК. Фиксация таких потенциальных мутационных повреждений связана с репликацией. При репликации ошибка в одной цепи ДНК ведет к формированию мутагенного клона, тогда как другая, нормальная, цепь обеспечивает правильный матричный синтез комплементарной цепи и образование клона дикого типа. Как же в таком случае можно объяснить факт образования полных мутаций? Для объяснения этого явления предложена репарационная гипотеза, согласно которой в клетках имеется какой-то фермент, способный удалить ошибочное основание до первой репликации, т.е. до момента фиксации мутации. В зависимости от того, какая из цепей ДНК подвергается коррекции в ходе последующего репаративного ресинтеза, а затем и вегетативной репликации, возникнут чистые клоны мутантного или дикого типа. При отсутствии коррекции появится смешанный клон. Известно, однако, что репаративные ферменты могут различать поврежденную и интактную цепи ДНК.

Гидроксиламин. В отличие от большинства алкилирующих агентов гидроксилирующий агент гидроксиламин NH₂OH обладает строго специфичным мутагенным действием. Он индуцирует преимущественно транзиции ГЦАТ. Механизм мутагенности гидроксиламина не вполне ясен, однако известно, что он предпочтительно взаимодействует с цитозином, присоединяя к нему аминогруппу. Такой модифицированный цитозин способен ошибочно спариваться с аденином, что и ведет к образованию транзиции ГЦАТ. Ввиду своей специфичности гидроксиламин часто используется для определения типа транзиции, вызванной другими мутагенами. Например, мутанты, возникшие в результате транзиций, могут быть разделены на два класса в зависимости от способности ревертировать под действием гидроксиламина. Очевидно, те из них, которые содержат в мутантном сайте пару АТ, не ревертируют. Напротив, если мутация привела к замене оснований типа АТГЦ, то она будет ревертировать.

Поскольку гидроксиламин способен действовать на покоящуюся ДНК, он эффективно используется в качестве агента индуцирующего in vitro мутации в трансформирующей ДНК бактерий либо у внеклеточных бактериофагов. Мутагенное действие гидроксиламина на эукариотические организмы выражено слабо.

Азотистая кислота. Азотистая кислота HNO₂ - сильный мутаген, действующий путем окислительного дезаминирования оснований, содержащих аминогруппы (гуанин, аденин, цитозин). Замещение аминогруппы кетогруппой превращает аденин в гипоксантин, спаривающийся преимущественно не с тимином, а с цитозином. Дезаминирование цитозина превращает его в урацил, спаривающийся с аденином. Дезаминирование гуанина переводит его в ксантин, однако это не нарушает специфичности спаривания, т.к. оба они образуют водородные связи с цитозином. Первые два типа дезаминирования ведут к транзициям АТГЦ и ГЦАТ соответственно. Поскольку азотистая кислота индуцирует транзиции в обоих направлениях, вызываемые ею мутации способны ревертировать при повторной обработке тем же мутагеном.

Помимо замен оснований азотистая кислота индуцирует делеции, что обусловлено ее способностью к поперечному сшиванию цепей ДНК. У эукариот мутагенное действие азотистой кислоты, по-видимому, также связано с вызываемыми ею сшивками между ДНК и гистоном. Показана мутагенность азотистой кислоты в отношении различных бактерий, бактериофагов, РНК-вых вирусов, грибов. In vitro азотистая кислота индуцирует мутации в трансформирующейся ДНК, но по эффективности уступает в этом отношении гидроксиламину.