Дорепликативная репарация

Наибольшее количество летальных для клетки повреждений ДНК устраняется до ее репликации с помощью нескольких процессов, которые могут идти одноэтапно или многоэтапно. Примеры одноэтапного процесса, осуществляющегося с помощью одного фермента: 1) фотореактивация; 2) обнаруженное в клетках млекопитающих прямое встраивание пуринов в апуриновые сайты ДНК с помощью особого фермента, называемого пурин-инсертазой; 3) репарация после действия простых алкилирующих агентов путем отщепления алкильных групп от О⁶-метил- и О⁶-алкилгуанина, являющаяся одним из звеньев адаптивного ответа клетки на действие сверхмалых доз указанных агентов; 4) воссоединение однонитевых разрывов ДНК при 3-ОН и 5-РО₄ концевых разрывах, разделенных лишь одним нуклеотидом. Эту реакцию катализирует ДНК-лигаза. К многоэтапным процессам дорепликативной репарации относят два типа темновой эксцизионной репарации. Один из них удаляет основание, другой - нуклеотиды. К многоэтапным процессам дорепликативной репарации ДНК относится уже упоминавшаяся репарация одно- и двухцепочечных разрывов, индуцированных ионизирующей радиации (рентгеновскими и -лучами), а также репарация ДНК, содержащей поперечные сшивки, обусловленные действием таких соединений, как митомицин С или псорален.

Фотореактивация

Фотореактивирующее действие видимого света связано с активностью фермента дезоксириботидпиримидинфотолиазы, специфично связывающейся с УФ-облученной ДНК и расщепляющей на мономеры основные УФ-фотопродукты - димеры двух соседних пиримидинов в одной цепи ДНК, объединенных циклобутановым кольцом. Фермент присоединяется к пиримидиновым димерам в ДНК в темноте, но реакция расщепления связей, объединяющих две молекулы пиримидина, энергетически зависима от видимого света. Особенно эффективен свет, лежащий в голубой части спектра. Подсчитано, что за 1 мин молекула фотолиазы может расщепить 2,4 димера. Фотолиазы, различающиеся по своим размерам (М_r 35 000-50 000), обнаружены у E. coli, некоторых дрожжей, в лимфоцитах человека. Все они относятся к ферментам типа флавопротеинов. В облученных клетках E. coli фотореактивация удаляет до 90% пиримидиновых димеров, что повышает выживаемость клеток и значительно снижает частоту мутаций. Однако есть данные о том, что эффективность удаления предмутационных повреждений в ходе фотореактивации зависит от типа повреждения. Так, при исследовании УФ-индуцированных мутаций в контролирующем образование аденина гене ad-3 у дрожжей и в rII области фага Т4 было показано, что фотореактивация не снижает числа мутаций с заменой оснований или со сдвигом рамки. Это свидетельствует о том, что димеры тимина не единственные факторы УФ-мутабильности и что в образовании УФ-индуцированных мутаций участвуют и другие фотопродукты. Подтверждением тому служат данные, показывающие, что (6-4) УФ-фотопродукты цитозина фотореактивации не подвергаются.

Темновая эксцизионная репарация

В отличие от фотореактивации другие пути репарации повреждений ДНК не нуждаются в энергии видимого света и поэтому относятся к темновой репарации.

Гипотеза о существовании темновой репарации повреждений, индуцированных УФ-лучами, была высказана в 1961 г. Э. Виткин и М. Либ на основе анализа двух взаимосвязанных явлений, обнаруженных при изучении мутагенеза у бактерий: фиксации мутаций и снижения частоты мутаций. Оба они касаются фактов замедленного проявления мутагенного действия УФ-лучей. Эта особенность наблюдалась еще в 30-х годах Л. Стадлером при анализе спектра индуцированных УФ-лучами генетических изменений у растений. Л. Стадлер построил модель действия УФ-лучей, в соответствии с которой повреждения хромосомы в виде ее разрыва или мутации - не одномоментный акт, а растянутый во времени процесс, в ходе которого фиксируются потенциальные мутационные повреждения. Такое отсроченное возникновение мутаций у бактерий выражено еще сильнее, чем у растений. Замедленный мутационный ответ характерен и для химического мутагенеза, особенно для действия алкилирующих агентов.

Анализ природы замедленных мутаций, индуцированных у E. coli УФ-лучами, проведенный Э. Виткин (1956) и Ч. Дадней с Ф. Хаасом (1958), показал, что реализация предмутационных повреждений или же их утрата зависят от того, на какой среде (обогащенной или бедной, лишенной необходимых для роста аминокислот) будут выращиваться бактерии в течение первых 1-1,5 ч после облучения. Оказалось, что инкубация облученных клеток в обогащенной среде обеспечивала высокую частоту мутаций независимо от того, в какой среде (богатой или бедной) велась последующая инкубация. Напротив, если вначале облученные бактерии 1-1,5 ч выдерживали в бедной (минимальной) среде, частота мутаций была низкой независимо от условий дальнейшей инкубации. Процесс постепенной утраты потенциальных мутаций из-за дефицита аминокислот в бедной среде был назван снижением частоты мутаций.

Восстановление нормальной структуры ДНК, содержащей не свойственные ей или модифицированные основания, обеспечивается эксцизионной репарацией. Процесс начинается с действия ферментов ДНК-гликозилаз, катализирующих гидролиз N-гликозидных связей между азотистым основанием и дезоксирибозой. ДНК-гликозилазы эффективно удаляют поврежденные либо не свойственные ДНК основания, появившиеся в ней спонтанно либо под действием УФ-, рентгеновских лучей, разнообразных алкилирующих агентов. В зависимости от типа оснований, в отношении которых проявляется активность этих ферментов, различают урацил-, гипоксантин-, 3-метиладенин-, 7-метилгуанин- и другие ДНК-гликозилазы. В результате удаления не свойственных ДНК (например, урацила) или модифицированных (например, гипоксантина, 3-метиладенина и др.) оснований, осуществляющегося без разрыва сахарофосфатного каркаса ДНК, образуются апуриновые или апиримидиновые сайты (АП-сайты), служащие, в свою очередь, субстратом действия еще одной группы ферментов, называемых АП-эндонуклеазами. Сочетанное действие ДНК-гликозилазы и АП-эндонуклеазы приводит к вырезанию АП-сайтов в составе олигонуклеотидов. На первом этапе в результате спонтанной потери оснований либо под действием ДНК-гликозилазы в полинуклеотидной цепи появляется АП-сайт. Далее этот сайт атакуется 3-АП-эндонуклеазой, вызывающей гидролиз фосфодиэфирных связей на 5-конце к АП-сайту, в результате чего освобождается 3-ОН конец. На следующем этапе олигонуклеотид, содержащий дезоксирибозофосфатный остаток, вырезается ферментом 5-АП-эндонуклеазой. Наконец, на последнем этапе образовавшаяся брешь закрывается в ходе репаративного синтеза, осуществляемого ДНК-полимеразой I, а ковалентные связи полинуклеотидной цепи восстанавливаются ДНК-лигазой.

Помимо оснований эксцизионная репарация удаляет и нуклеотиды. Этим механизмом из ДНК вырезаются индуцированные УФ-лучами пиримидиновые димеры. Следует отметить, что длительное время основным способом такой репарации считали выщепление димеров в результате совместного действия эндонуклеаз, осуществляющих одноцепочечный надрез (инцизию) вблизи димера, и экзонуклеаз, вырезающих более или менее протяженный участок цепи, содержащий димер. Последующее восстановление интактности молекулы ДНК достигается путем закрывания бреши в ходе репаративного синтеза недостающего участка цепи с помощью ДНК-полимеразы I, использующей противоположную цепь как матрицу. Эта классическая схема в недавнее время пересмотрена. При исследованиях этапа инцизии, проведенных на бактериях Micrococcus luteus, было обнаружено, что ответственный за этот этап фермент УФ-эндонуклеаза обладает двумя видами активности. Первая из них, ДНК-гликозилазная, специфичная в отношении пиримидиновых димеров (ПД-ДНК-гликозилаза), расщепляет N-гликозильную связь между 5-пиримидином димера и соседним основанием. Вторая, АП-эндонуклеазная, разрывает сахарофосфатный каркас. Подобная бифункциональность присуща и УФ-эндонуклеазе, кодируемой геном den V фага Т4.

В клетках Е.coli выщепление пиримидиновых димеров контролируется тремя генами uvr (от англ. ultraviolet radiation) - А, В и С, кодирующими три связывающихся с ДНК белка, которые только совместно обладают активностью УФ-эндонуклеазы. Фермент, называемый эксцизионной нуклеазой UVRABC, надрезает ДНК вблизи димера, содержащего тимин. Один надрез находится на расстоянии 7 нуклеотидов от 3-конца, другой - 5-6 нуклеотидов от 5-конца. В результате нуклеаза UVRABC удаляет из поврежденной ДНК 12-13 нуклеотидов вместе с пиримидиновым димером. Образовавшийся пробел в ходе репаративного ресинтеза заполняется ДНК-полимеразой, а целостность сахарофосфатного каркаса ДНК восстанавливается ДНК-лигазой. Подобный мультиферментный комплекс выявлен и у других бактерий, а также у дрожжей. Наряду с вырезанием тиминовых димеров нуклеаза UVRABC, ДНК-гликолиазы и др. ферменты с эндонуклеотической активностью принимают участие в репарации ДНК.

Действие эксцизионной репарации проявляется и в отношении ДНК с АП-сайтами. Такие сайты образуются спонтанно в случае тепловых флуктуаций в молекуле ДНК, приводящих к потере модифицированных оснований; при действии ионизирующей радиации и алкилирующих агентов; при репарации ДНК с участием ДНК-гликозилаз. В отсутствие репарации накопление в ДНК АП-сайтов может привести клетку к гибели, т.к. они не обладают кодирующими свойствами и препятствуют в основном безошибочной репликации ДНК. Показано, что число ошибок, возникающих при синтезе новой цепи ДНК с помощью ДНК-полимеразы I на матрице ДНК, содержащей АП-сайты, увеличивается в 3-6 раз.

Известны два пути эксцизионной репарации: короткими участками и длинными участками. Первый из них более эффективный и быстрый. У E. coli основной фермент, ведущий репаративный синтез ДНК короткими участками, - ДНК-полимераза I. С помощью этого типа ресинтеза репарируется до 99% пробелов, возникающих в результате вырезания участка, содержащего повреждения. Величина ресинтезированного фрагмента составляет 13-24 нуклеотида, что близко к размеру олигонуклеотида, удаляемого нуклеазой UVRABC. Присущая ДНК-полимеразе I, помимо полимеразной, 5-3-экзонуклеазная активность не участвует в самом выщеплении фрагмента ДНК, несущего повреждения, как это предполагалось ранее, а обеспечивает формирование разрывов в ДНК, представляющих собой субстраты для последующего действия ДНК-лигазы, сшивающей сахарофосфатный каркас на завершающем этапе репарации.

ДНК-полимераза I - полифункциональный фермент. Мутации в гене polA, кодирующем ДНК-полимеразу I у E. coli, значительно увеличивают чувствительность клеток к летальному действию УФ-лучей, ионизирующей радиации, алкилирующих агентов.

У E. coli помимо ДНК-полимеразы I в репаративном синтезе ДНК участвуют ДНК-полимеразы II и III. Установлено, что ДНК-полимераза II участвует в репаративном синтезе длинными фрагментами при эксцизионной репарации и в пострепликативной репарации ДНК в УФ-облученных клетках. В основном же репаративный синтез длинными фрагментами длиной 1000-1500 нуклеотидов в УФ-облученных клетках E. coli ведет ДНК-полимераза III. Этот путь обеспечивает репарацию около 1% пробелов, возникающих в ходе эксцизионной репарации. Помимо ДНК-полимеразы III еще несколько ферментов одновременно участвует в репарации и вегетативной репликации ДНК. К ним, в частности, относятся праймаза, обеспечивающая синтез РНК-затравки, необходимой для инициации репликации ДНК и синтеза фрагментов Оказаки, белки, участвующие в расплетении двухцепочечной ДНК (ДНК-хеликазы, белок SSB, ДНК-гираза и некоторые другие).

Способность эксцизионной репарации обнаружена не только у бактерий, но и у двухцепочечных фагов. Известна она и у эукариот. У млекопитающих показателем эксцизионной репарации служит “внеплановый” синтез ДНК вне периода S клеточного цикла во время нормальной полуконсервативной репликации хромосомы. Способность к репарации ДНК нарушена у лиц с наследственным заболеванием - пигментной ксеродермой - болезнью, при которой солнечное облучение приводит к развитию злокачественной опухоли кожи. Установлено, что у некоторых из этих больных подавлена активность УФ-эндонуклеазы, у других - ДНК-полимеразы I. Клетки больных первого типа, культивируемые in vitro, не способны к удалению димеров из ДНК, а клетки больных второго типа не могут репарировать ДНК, содержащую одноцепочечные разрывы.

В процессе эксцизионной репарации устраняется основная доля предмутационных повреждений ДНК, индуцированных УФ-лучами, поскольку субстратом ее действия служат не только циклобутановые димеры тимина, но и (6-4) УФ-фотопродукты цитозина. Последующий репаративный ресинтез ДНК обычно безошибочен и ведет к восстановлению исходной последовательности ДНК. Восстановление нормальной структуры ДНК, содержащей сравнительно небольшое число димеров, оставшихся в ней после того, как исчерпались возможности фотореактивации и эксцизионной репарации, осуществляется в ходе пострепликативной репарации.