Этапы транскрипции

Различают три этапа транскрипции: инициацию, элонгацию и терминацию.

Инициация

Последовательность ДНК, транскрибирующаяся в одну иРНК, начинающаяся просмотром на 5-конце и заканчивающаяся терминатором на 3-конце, является единицей транскрипции и соответствует современному понятию “ген”. Контроль экспрессии генов может осуществляться на этапе инициации транскрипции. На этом этапе РНК-полимераза распознает промотор - фрагмент длиной 41-44 п.н. Транскрипция ДНК происходит в направлении 5-3, или слева направо. Последовательности, лежащие вправо от стартового нуклеотида, с которого начинается синтез иРНК, обозначаются номерами со знаком “+” (+1, +2 и т.д.), а находящееся левее - со знаком “-” (-1,-2 и т.д.). Таким образом, область ДНК, к которой присоединяется РНК-полимераза, занимает участок с координатами  от -20 до +20. Минимальный участок, связанный с РНК-полимеразой, состоит у E.coli из 12 п.н. Во всех промоторах присутствуют одни и те же нуклеотидные последовательности, называемые консервативными. Такие последовательности служат сигналами, распознаваемыми РНК-полимеразами. Стартовая точка обычно, хотя и не всегда, представлена пурином (чаще аденином, чем гуанином). Сразу же влево от нее располагаются 6-9 п.н., известные как последовательность (или ящик) Прибнова: ТАТААТ. Она может несколько варьировать, но первые два основания (ТА), по крайней мере, у E.coli, встречаются в большинстве промоторов. Предполагается, что, поскольку ее образует участок богатый АТ-парами, связанными двумя, а не тремя, как ГЦ-пары, водородными связями, ДНК в этом месте легче разделяется на отдельные нити. Это создает условия для функционирования РНК-полимеразы. Наряду с этим последовательность Прибнова нужна для ориентирования РНК-полимеразы таким образом, чтобы синтез иРНК шел слева направо, т.е. в направлении 5-3. Центр “ящика Прибнова” приходится на нуклеотид в положении -10. Близкая по составу последовательность расположена в другом участке с центром в положении -35, т.е. на расстоянии 35 п.н. от стартовой точки. Этот участок, состоящий из 9 п.н., обозначают как последовательность 35, или район распознавания. Он является сайтом, к которому присоединяется -фактор, тем самым определяя эффективность, с которой РНК-полимераза распознает определенный промотор. Есть промоторы, с которых РНК-полимераза не может начать транскрипцию без помощи специальных белков. Одним из них служит фактор САР, или CRP.

Изменение специфичности распознавания субстрата РНК-полимеразой может серьезно отразиться на жизнедеятельности организма. Так, образование спор сенной палочки (Bacillus subtilis) зависит от того, какой из -факторов функционирует. Замена -фактора с М_r 55000 на -фактор с М_r 37000 и 29000 при неизменности кор-фермента приводит к тому, что РНК-полимераза начинает распознавать и транскрибировать хромосомные гены, ответственные за ранние и последующие этапы спорообразования. С заменами -фактора связано также переключение транскрипции с одних генов на другие у фага SPOI B. subtilis. Каждый -фактор распознает собственные, характерные для него последовательности в промоторе с координатами- 10 и -35. Недавно это продемонстрировано и на E.coli. Известно, что при инкубации при повышенной температуре (42⁰ С) в клетках E.coli начинает интенсивно экспрессироваться группа генов, объединяемая общим названием “гены теплового шока”. В отличие от других генов E.coli, транскрибирующихся РНК-полимеразой, содержащей -фактор с М_r 70000, гены теплового шока транскрибируются комплексом кор-фермента РНК-полимеразы с иным -фактором с М_r 32000. Примечательно, что в эту группу генов входит и ген, кодирующей -фактор с М_r 70000. Следовательно, второй -фактор придает клетке дополнительные возможности для избирательной регуляции генной активности, направленной, в частности, на усиление продукции основного -фактора, повышающее уровень транскрипции в клетке в ответ на изменение внешних условий.

У эукариот более подробно изучены промоторы, взаимодействующие с РНК-полимеразой II. Они содержат три гомологичных участка в районах с координатами -25, -27, а также в стартовой точке. Стартовым основанием служит аденин, фланкированный с обеих сторон пиримидинами. На расстоянии 19-27 п.н. влево от этого участка расположены 7 п.н. ТАТАА (или Т)АА (или Т), известных как последовательность ТАТА, или “ящик Хогнесса”. Часто он окружен участками, богатыми ГЦ-парами. Последовательность ТАТА напоминает “ящик Прибнова” у прокариот, но расположена в среднем на 15 п.н. левее стартовой точки. Еще левее в положении от -70 до -80 находится последовательность ГТЦ (или Т) ЦААТЦТ, называемая также “ящик ЦААТ”. Предполагается, что последовательность ТАТА контролирует выбор стартового нуклеотида, а ЦААТ - первичное связывание РНК-полимеразы с ДНК-матрицей.

Элонгация

Стадия элонгации иРНК имеет ряд аналогий с элонгацией ДНК. В качестве предшественников для нее необходимы рибонуклеозидтрифосфаты. Этап элонгации транскрипции, т.е. рост цепи иРНК, происходит путем присоединения рибонуклеозидмонофосфатов к 3^/-концу цепи с одновременным освобождением пирофосфата. Копирование у эукариот обычно осуществляется на ограниченном участке ДНК (т.е. в пределах гена), хотя у прокариот в ряде случаев транскрипция может проходить последовательно через несколько сцепленных генов (цистронов), формирующих единый оперон, и с одного общего промотора. В таком случае образуется полицистронная иРНК.

Терминация

Транскрипция завершается в специфическом участке ДНК, содержащем терминирующую последовательность. В клетках E.coli выявлен особый белок (ро-фактор), повышающий точность терминации. Белок присоединяется к 5^/-концу растущей иРНК и продвигается по ней, постепенно приближаясь к ДНК и как бы преследуя РНК-полимеразу. В момент, когда РНК-полимераза останавливается в сайте-терминаторе, фермент захватывается ро-фактором и сбрасывается с ДНК. Терминатор содержит особую последовательность оснований, прочитывающуюся одинаково в обеих цепях ДНК, но в противоположных направлениях.

Например:

5^/ ЦЦА ТГГ 3^/

3^/ ГГТ АЦЦ 5^/

Такие симметричные структуры, называемые палиндромами, встречаются в различных участках ДНК и играют важную регуляторную роль. Палиндромы представляют собой районы двойной симметрии, поскольку ось симметрии проходит у них таким образом, что с каждой ее стороны находится одна и та же последовательность, но с противоположной ориентацией. Такие последовательности называют инвертированными повторами. Повторы в ДНК или РНК на небольшом участке изменяют их вторичную структуру, придавая ей форму креста или шпильки. Они распознаются различными ферментами в качестве регуляторных сигнальных элементов. Так, РНК-полимераза останавливается на ДНК, как только синтезируемая ею иРНК образует структуру шпильки, указывающую на то, что в данном участке ДНК находится палиндром.